本文選題：酮還原酶 + 雙順反子表達(dá)��； 參考：《河北大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯是合成眾多血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑的關(guān)鍵手性仲醇。利用酮還原酶制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯具有一定優(yōu)勢(shì),受到了很多研究者的青睞。酮還原酶催化還原酮類化合物需要輔酶還原態(tài)的NAD(P)H提供氫。在生產(chǎn)上,為了使酮還原酶催化反應(yīng)順利進(jìn)行降低生產(chǎn)成本,目前主要是將酮還原酶與脫氫酶進(jìn)行共表達(dá),構(gòu)建共表達(dá)系統(tǒng)。本論文以光滑假絲酵母的酮還原酶CgKR2基因和巨大芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶BmGDH基因作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,先克隆了兩個(gè)目標(biāo)基因,通過基因定向克隆技術(shù),構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET17b-TC-CgKR2和pET17b-TC-BmGDH;設(shè)計(jì)了“T7promoter-T7 RBS-CgKR2-T7 RBS-BmGDH-T7 terminator”雙順反子結(jié)構(gòu),通過重疊延伸PCR、基因定向克隆等技術(shù)構(gòu)建成表達(dá)載體pET17b-TC-CgKR2-BmGDH。經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá),重組菌BL21-pET17b-TC-CgKR2-BmGDH、BL21-pET17b-TC-C gKR2均高效表達(dá)出目的蛋白,表達(dá)條帶分子量大小與預(yù)期一致。上述研究驗(yàn)證了定向克隆的可行性,并為后續(xù)的催化活性研究奠定了基礎(chǔ)。為了提高發(fā)酵工程菌中質(zhì)粒的穩(wěn)定性,使CgKR2基因高效穩(wěn)定表達(dá),本論文設(shè)計(jì)了質(zhì)粒依賴系統(tǒng)。將大腸桿菌基因組中條件必須基因敲除,然后將功能正常的基因轉(zhuǎn)移到表達(dá)質(zhì)粒上,這樣菌的生長就與質(zhì)粒形成一種依賴關(guān)系。在質(zhì)粒改造階段,本論文選擇了磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpiA)和葡萄糖胺合酶的基因(glmS)作為質(zhì)粒依賴系統(tǒng)中所需敲除的條件必須基因。從大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)中克隆了tpiA、glmS兩個(gè)基因。在重組質(zhì)粒pUCm-tpi A和pET17b-TC質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建了最終的互補(bǔ)表達(dá)質(zhì)粒。論文選用了溫敏型質(zhì)粒pMAK705來進(jìn)行宿主菌的基因敲除。首先克隆待敲除基因tpiA、glmS前后同源區(qū)PCR-T3、PCR-T5、PCR-G3、PCR-G5,對(duì)應(yīng)上下游片段兩兩重疊延伸,然后連接到溫敏型質(zhì)粒pMAK705中,構(gòu)建成功tpiA、glmS基因敲除的滅活質(zhì)粒pMAK705-tpiA和pMAK705-glmS,為CgKR2基因質(zhì)粒依賴系統(tǒng)的建立奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The recombinant plasmid pET17b - TC - CgKR2 and pET17b - TC - BGDH was constructed by using ketoreductase CgKR2 gene and Bacillus megaterium glucose dehydrogenase gene .
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1909567