發(fā)布時間：2018-05-19 03:11

  本文選題：卵母細胞 + 玻璃化冷凍��； 參考：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：卵母細胞和胚胎玻璃化冷凍技術(shù)是輔助生殖技術(shù)的重要組成部分,其廣泛應(yīng)用于優(yōu)良家畜、珍稀和瀕危動物的保種和人類不孕不育癥的治療等領(lǐng)域。隨著科研人員的不斷努力,玻璃化冷凍技術(shù)日趨成熟,應(yīng)用也越來越普遍。但是,近年來的研究發(fā)現(xiàn),玻璃化冷凍不僅對其細胞超微結(jié)構(gòu)以及細胞膜等造成不良影響,還對其卵母細胞或者胚胎DNA甲基化水平、發(fā)育基因的表達、DNA損傷和印記基因等產(chǎn)生影響,對胚胎發(fā)育以及后代存在潛在風(fēng)險。本研究使用卵母細胞單細胞凝膠電泳、免疫熒光染色、qRT-PCR和TUNEL染色等方法,分析了卵母細胞玻璃化冷凍對MⅡ期卵母細胞及胚胎DNA損傷的影響;同時使用qRT-PCR和亞硫酸氫鹽測序法,檢測了卵母細胞玻璃化冷凍對MⅡ期卵母細胞及受精后代印記基因H19和Gtl2差異甲基化區(qū)域(DMRs)DNA甲基化狀態(tài)及表達的影響。獲得了如下研究結(jié)果:1、卵母細胞單細胞凝膠電泳實驗研究表明,冷凍組和對照組的尾部DNA和OTM值差異不顯著;免疫熒光染色顯示,冷凍組和對照組MⅡ期卵母細胞中γH2AX水平差異不顯著,而5hmC水平顯著升高;冷凍卵母細胞激活發(fā)育到2-cell,冷凍組的γH2A X位點數(shù)與對照組比較顯著升高(P0.05),5hmC水平也顯著升高(P0.05);在MⅡ期卵母細胞中,53BP1、Casp3、Fas、Gadd45a和Ddit3中表達水平差異不顯著;在2-cell中,Casp3和Fas的表達水平變化差異不顯著,53BP1、Gadd45a和Ddit3表達水平顯著升高(P0.05);冷凍組卵母細胞孤雌激活后卵裂率和囊胚率顯著降低(P0.05),囊胚凋亡細胞數(shù)顯著上升(P0.05)。2、在MⅡ期卵母細胞中,冷凍組和對照組的H19甲基化狀態(tài)沒有顯著差異(P0.05),冷凍組Gtl2差異甲基化區(qū)域的平均甲基化水平(5.83%)顯著低于對照組(9.22%)(P0.05);冷凍后卵母細胞印記基因H19的表達水平無顯著變化(P0.05),而GTl2表達水平顯著下降;在冷凍卵母細胞體外受精和胚胎移植后,對獲得的性成熟仔鼠的心臟、脾臟、肺臟和腎臟進行檢測,發(fā)現(xiàn)Gtl2差異甲基化區(qū)域DNA甲基化水平與對照差異不顯著(P0.05),肝臟檢測發(fā)現(xiàn),冷凍組Gtl2差異甲基化區(qū)域DNA甲基化水平顯著高于對照組(P0.05);實時定量的結(jié)果顯示,在脾臟和腎臟中Gtl2表達水平變化不明顯(P0.05),心臟、肝臟和肺臟中Gtl2表達水平顯著上升(P0.05)。結(jié)論:MⅡ期卵母細胞玻璃化冷凍-解凍后,未檢測到明顯的DNA損傷,但是冷凍卵母細胞發(fā)育到2-cell期,可以檢測到DNA損傷的發(fā)生,并且檢測發(fā)現(xiàn)53BP1、Gadd45a和Ddit3表達上調(diào)。卵母細胞玻璃化冷凍后早期胚胎發(fā)育卵裂率和囊胚率降低,囊胚凋亡細胞數(shù)上升。卵母細胞玻璃化冷凍會影響MⅡ期卵母細胞印記基因Gtl2的表達和差異甲基化區(qū)域DNA甲基化水平,也會對獲得的仔鼠器官中印記基因Gtl2的表達和差異甲基化區(qū)域DNA甲基化水平造成影響。
[Abstract]:Vitrification of oocytes and embryos is an important part of assisted reproductive technology, which is widely used in the fields of good livestock, conservation of rare and endangered animals and treatment of infertility. With the continuous efforts of researchers, vitrification technology is becoming more and more mature, and its application is becoming more and more common. However, recent studies have found that vitrification not only has adverse effects on the ultrastructure and cell membrane, but also on the DNA methylation level of oocytes or embryos. The expression of developmental genes, such as DNA damage and imprinted genes, has a potential risk to embryo development and offspring. In this study, the effects of vitrification of oocytes on DNA damage in M 鈪，

本文編號：1908452