發(fā)布時(shí)間：2018-05-14 17:17

  本文選題：家蠶微孢子蟲 + 海藻糖合成酶　； 參考：《蠶業(yè)科學(xué)》2017年05期

【摘要】：海藻糖在保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膜和生物大分子空間結(jié)構(gòu),維持胞內(nèi)滲透壓增大的過程中發(fā)揮重要作用,海藻糖合成酶是海藻糖合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶。通過檢索微孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)基因組中含有4個(gè)海藻糖合成酶基因,其中Nbtps1基因的開放閱讀框長1 386 bp,為單外顯子結(jié)構(gòu),編碼461個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量53.7 k D,等電點(diǎn)5.19。Nb TPS1蛋白序列含有1個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn),亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)中。多重序列比對(duì)分析結(jié)果表明,Nb TPS1與東方蜜蜂微孢子蟲(Nosema ceranae)、兔腦炎微孢子蟲(Encephalitozoon cuniculi)海藻糖合成酶的氨基酸序列相似度分別為59.0%、54.7%,系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示三者的親緣關(guān)系與之相符。構(gòu)建重組表達(dá)載體Nbtps1/p ET-28a(+)并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Rosetta(DE3)菌株,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及親和純化后獲得最終質(zhì)量濃度為1.18 mg/m L的重組融合蛋白His-Nb TPS1。用純化后的融合蛋白制備兔多克隆抗體Anti-Nb TPS1,利用間接ELISA法測(cè)定多克隆抗體的效價(jià)達(dá)1∶25 600,并通過Western blotting檢測(cè)驗(yàn)證了該多克隆抗體的特異性,為研究Nb TPS1的生物學(xué)功能以及家蠶微孢子蟲的間接免疫檢測(cè)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Trehalose plays an important role in protecting cytoplasmic membrane and biological macromolecular spatial structure and maintaining the increase of intracellular osmotic pressure. Trehalose synthase is a key enzyme in trehalose biosynthesis pathway. By searching the genome database of Microsporidium, we found that there are four trehalose synthase genes in the genome of Bombyx mori Nosema bombycis. the open reading frame of Nbtps1 gene is 1 386 BP, which is a single exon structure and encodes 461 amino acid residues. The predicted molecular weight of the protein was 53.7 KD, the isoelectric point 5.19.Nb TPS1 protein sequence contained one glycosyltransferase domain and four potential N-glycosylation sites, and the subcellular localization predicted that the protein was located in the cytoplasm. The results of multiple sequence alignment analysis showed that the amino acid sequence similarity of the trehalose synthase between Nb TPS1 and Nosema ceranaeae, Encephalitozoon cuniculil, Encephalitozoon cuniculide was 59.00.The phylogenetic tree showed that the phylogenetic tree was consistent with the phylogenetic tree. The recombinant expression vector Nbtps1/p ET-28a () was constructed and transformed into Escherichia coli strain Rosetta-DE3. The recombinant fusion protein His-Nb TPS1 with final mass concentration of 1.18 mg/m L was obtained by IPTG induction and affinity purification. Rabbit polyclonal antibody Anti-Nb TPS1 was prepared from purified fusion protein. The titer of polyclonal antibody was 1:25 600 by indirect ELISA assay. The specificity of the polyclonal antibody was verified by Western blotting detection. The results provided an experimental basis for the study of the biological function of NB TPS1 and the indirect immunoassay of Bombyx mori microsporidium.
【作者單位】： 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所;江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所;
【基金】：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(No.CARS-22) 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31560675)
【分類號(hào)】：S884

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本文編號(hào)：1888782