本文選題：三角帆蚌 + 基質金屬蛋白酶��； 參考：《南昌大學》2017年碩士論文

【摘要】：三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我國重要的淡水育珠蚌之一,育珠插核過程中傷口容易受到病原體侵染,使育珠蚌的吐核率升高,甚至造成蚌的死亡。因此,開展對其分子免疫及傷口修復機制的研究具有重要的理論和實際意義。本文采用RACE PCR技術分別克隆出了三角帆蚌的基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)和基質金屬蛋白酶-19(MMP-19)的cDNA序列,利用實時熒光定量PCR方法檢測2種基因在健康蚌血淋巴、肝胰臟、閉殼肌、外套膜和鰓5種組織中的表達情況;以及嗜水氣單胞菌和肽聚糖(PGN)刺激后,2種基因在血液和肝胰臟中的表達變化;通過建立三角帆蚌創(chuàng)傷修復模型,利用實時熒光定量PCR方法檢測2種基因在傷口修復期間不同時間段的表達情況;利用原核表達技術對2種基因進行了原核表達。MMP1基因的cDNA全長序列為1822 bp,其中5’UTR(非編碼區(qū))有31 bp;3’UTR有258 bp;開放閱讀框(ORF)的堿基長度為1533 bp,共編碼510個氨基酸。經Expasy在線網站的SignalP 4.0分析氨基酸發(fā)現(xiàn)該蛋白含有信號肽序列,該蛋白理論分子量為58.28 kDa,等電點為9.27�？寺〉玫降腗MP19基因序列長度2130 bp,其中5’UTR 29 bp,3’UTR長度為532 bp,開放閱讀框長度為1569 bp,共編碼522氨基酸,經分析發(fā)現(xiàn)該蛋白含有信號肽序列。推導的蛋白分子量為59.44 kDa,等電點為6.83。MMP1,19基因的mRNA在健康蚌的血液、外套膜、肌肉、鰓和肝胰腺中均有表達。其中,MMP1和MMP19均在在血液中表達量最高。MMP1在嗜水氣單胞菌刺激后,在24 h的血液和肝胰臟中均表達量極顯著性上升;在PGN誘導后3 h的血液中極顯著性上調,在肝胰臟中表達量無顯著變化。MMP19經PGN和嗜水氣單胞菌刺激后在肝臟中表達量變化不明顯,在血液中經PGN誘導后MMP19表達量上調,在3 h表達量最高。經嗜水氣單胞菌刺激后MMP19在血液中呈上調趨勢,24 h表達量最高。MMP1基因在創(chuàng)傷后的第3 d表達量最高,MMP19基因在創(chuàng)傷后第1 d表達量最高,隨著時間的增加,2種基因的表達量呈降低趨勢,到達第15 d時表達量恢復到初始水平。將三角帆蚌MMP1,19基因的擴增產物和表達載體PET-28a利用BamHI、Hind III和EcoRI、HindIII雙酶切之后,連接并成功構建了pET-28a-MMP1和pET-28a-MMP19原核表達重組質粒。將重組質粒轉入大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中進行原核表達,經SDS-PAGE電泳檢測,結果表明重組蛋白均以不溶的包涵體形式存在,純化出的MMP19蛋白濃度為0.094 mg/m L。
[Abstract]:Hyriopsis cumingii (Hyriopsis cumingii) is one of the most important freshwater Hyriopsis cumingii in China. The wound of Hyriopsis cumingii is easy to be infected by pathogen during the process of bead implantation, which results in the increase of spitting rate of Hyriopsis cumingii and even the death of Hyriopsis cumingii. Therefore, it has important theoretical and practical significance to study its molecular immunity and wound repair mechanism. The cDNA sequences of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) and matrix metalloproteinase-19 (MMP-19) of mussel Hyriopsis cumingii were cloned by RACE PCR technique, and real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the two genes in the hemolymph, hepatopancreas and obturator muscle of healthy mussel. The expression changes of the two genes in blood and hepatopancreas after stimulation of Aeromonas hydrophila and peptidoglycan PGN. were established by establishing a wound repair model of Hyriopsis cumingii. The expression of two genes during wound repair was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The full-length cDNA sequence of prokaryotic expression. MMP1 gene of two genes was 1822 BP, of which 5 UTRs (non-coding region) had 31 BP / 3 UTR (258bp), and the length of open reading frame (ORF) was 1533 BP, encoding 510 amino acids. It was found that the protein contained signal peptide sequence by SignalP 4.0 analysis of Expasy online website. The theoretical molecular weight and isoelectric point of the protein were 58.28 kDa and 9.27 respectively. The length of the cloned MMP19 gene was 2130 BP, of which the length of the 5'UTR 29 bpt3 UTR was 532bpand the length of the open reading frame was 1569 BP, encoding 522 amino acids. It was found that the protein contained a signal peptide sequence. The deduced protein molecular weight was 59.44 kDa.The isoelectric point was 6.83.MMP1n19 gene mRNA was expressed in the blood, mantle, muscle, Gill and hepatopancreas of healthy mussel. After stimulation by Aeromonas hydrophila, the expression of MMP1 and MMP19 in the blood and hepatopancreas increased significantly at 24 h, and in the blood at 3 h after PGN induction, the expression of MMP1 and MMP1 increased significantly. There was no significant change in the expression of MMP19 in hepatopancreas. MMP19 was stimulated by PGN and Aeromonas hydrophila. The expression of MMP19 was not changed significantly in liver, but the expression of MMP19 was up-regulated in blood induced by PGN, and reached the highest level at 3 h. After stimulation by Aeromonas hydrophila, the expression of MMP19 in blood showed an up-regulation trend. The highest expression of MMP1 gene was observed on the 3rd day after trauma. The expression of MMP19 gene was the highest on the first day after trauma. With the increase of time, the expression of the two genes decreased, and the expression returned to the initial level at the 15th day. The amplification product of MMP1O19 gene and the expression vector PET-28a were digested by BamHIHind III and Ecor I HindIII, and the prokaryotic expression plasmids pET-28a-MMP1 and pET-28a-MMP19 were successfully constructed. The recombinant plasmid was transferred into E. coli Rosetta-gamide _ 3 for prokaryotic expression. The results of SDS-PAGE electrophoresis showed that the recombinant protein existed in the form of insoluble inclusion bodies, and the concentration of purified MMP19 protein was 0.094 mg/m / L.
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S944.12

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