本文選題：酮化酶 + 小球藻��； 參考：《合肥工業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：蝦青素是一種次生類胡蘿卜素,具有超強的抗氧化性,在生物體內(nèi)能淬滅單線態(tài)氧、清除自由基,可以防止機體衰老,增強免疫力。同時還具有抗癌抑癌、預防心血管疾病等生物學功能,廣泛應用于食品、醫(yī)藥和保健品等行業(yè)。小球藻含有蝦青素,具有生長速度快、生物密度高、易培養(yǎng)等優(yōu)點,是很好的生物反應器。但是小球藻中蝦青素含量低,應用基因工程的方法提高蝦青素含量成為近年來研究的熱點。農(nóng)桿菌具有操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高、經(jīng)濟實用等優(yōu)點,近年來廣泛應用于藻類的遺傳轉(zhuǎn)化。本研究建立農(nóng)桿菌介導的小球藻遺傳轉(zhuǎn)化的方法,構(gòu)建β-胡蘿卜素酮化酶基因表達載體,并通過農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)入小球藻中,提高蝦青素含量。本論文具體研究內(nèi)容和成果如下:1、篩選體系的確定:研究羧芐青霉素對農(nóng)桿菌和小球藻的影響,羧芐青霉素濃度為200mg/L時抑制農(nóng)桿菌的生長,羧芐青霉素對小球藻生長無影響。研究小球藻在BBM液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中對G418的敏感性,確定在BBM液體培養(yǎng)中G418的篩選濃度為1mg/L;在BBM固體培養(yǎng)基中G418的篩選濃度為2mg/L。最終確定BBM液體培養(yǎng)基中G418濃度為1mg/L和羧芐青霉素濃度為500mg/L的小球藻篩選體系;在固體培養(yǎng)基中G418濃度為2mg/L和羧芐青霉素濃度為500mg/L的小球藻篩選體系。2、以GFP為報告基因,以G418抗性基因(NPT II)作為篩選標記基因,CaMV35S為啟動子,PBI121為載體,利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的方法,建立小球藻遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過PCR驗證,GFP基因在小球藻內(nèi)完成基因重組;通過RT-PCR驗證,GFP基因成功轉(zhuǎn)錄;在激光共聚焦下轉(zhuǎn)化子顯示綠色熒光,GFP基因成功翻譯。轉(zhuǎn)化200天后,陽性鑒定依然為陽性,GFP穩(wěn)定遺傳表達。3、構(gòu)建PBI121::35S::PDSSP-BKT載體。PDSSP為調(diào)控八氫番茄紅素的信號肽基因,BKT為β-胡蘿卜素酮化酶基因,先通過overlap PCR技術(shù)克隆獲得PDSSP-BKT融合基因。4、利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的方法,將PDSSP-BKT融合基因轉(zhuǎn)入小球藻,并篩選陽性轉(zhuǎn)化子,提取蝦青素,通過HPLC測定,在相同培養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)化子中蝦青素含量比野生型高63.5%。
[Abstract]:Astaxanthin (astaxanthin) is a kind of secondary carotenoid. It can quench singlet oxygen and scavenge free radical in organism. It can prevent aging and enhance immunity. It also has the biological functions of anticancer and cancer suppression, cardiovascular disease prevention and so on. It is widely used in food, medicine and health products. Chlorella microphylla contains astaxanthin, which has the advantages of fast growth rate, high biological density and easy to culture, so it is a good bioreactor. However, the content of astaxanthin in Chlorella vulgaris is low, and the application of genetic engineering to improve the content of astaxanthin has become a hot topic in recent years. Agrobacterium tumefaciens has been widely used in genetic transformation of algae in recent years because of its advantages of simple operation, high efficiency, economy and practicality. In this study, a method of Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of Chlorella vulgaris was established, and 尾 -carotene ketonase gene expression vector was constructed and transferred into Chlorella vulgaris by Agrobacterium tumefaciens to increase astaxanthin content. The specific contents and results of this paper are as follows: 1. The effects of Carbenicillin on Agrobacterium tumefaciens and Chlorella vulgaris were studied. When the concentration of Carbenicillin was 200mg/L, the growth of Agrobacterium tumefaciens was inhibited, but Carbenicillin had no effect on the growth of Chlorella microphylla. The sensitivity of Chlorella vulgaris to G418 in BBM liquid medium and solid medium was studied. The screening concentration of G418 in BBM liquid culture was 1 mg / L and that in BBM solid medium was 2 mg / L. The screening system of Chlorella vulgaris with G418 concentration of 1mg/L and Carbenicillin concentration of 500mg/L in BBM liquid medium and Chlorella vulgaris screening system with G418 concentration of 2mg/L and Carbenicillin concentration of 500mg/L in solid medium were determined. GFP was used as reporter gene. The genetic transformation system of Chlorella microphylla was established by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation with G418 resistant gene NPT II as a screening marker gene CaMV35S as promoter PBI121. The GFP gene was recombined in Chlorella vulgaris by PCR, the GFP gene was successfully transcribed by RT-PCR, and the green fluorescent GFP gene was successfully translated by confocal laser. After 200 days of transformation, the positive identification was still positive for the stable genetic expression of GFP. PBI121::35S::PDSSP-BKT vector. PDSSP was constructed as the signal peptide gene to regulate the octyllycopene. BKT was 尾 -carotene ketone enzyme gene. The PDSSP-BKT fusion gene. 4 was cloned by overlap PCR technique. The PDSSP-BKT fusion gene was transferred into Chlorella vulgaris by Agrobacterium tumefaciens, and the positive transformants were screened. Astaxanthin was extracted by HPLC assay under the same culture conditions. The content of astaxanthin in transformants was 63.5% higher than that in wild type.
【學位授予單位】：合肥工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2

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