本文選題：志賀菌 + 插入序列��； 參考：《鄭州大學》2017年碩士論文

【摘要】：志賀菌屬通稱痢疾桿菌,是感染性腹瀉的常見致病菌之一,可引起細菌性痢疾。隨著各類抗生素在臨床的長期和廣泛使用,志賀氏菌的耐藥問題日益嚴重。耐藥基因的水平轉移(horizontal gene transfer,HGT)是大多數(shù)細菌產(chǎn)生耐藥性尤其是多重耐藥性的主要方式之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs),連同CRISPR相關基因(Cas)及其編碼的Cas蛋白共同組成CRISPR/Cas免疫系統(tǒng),它廣泛存在于細菌和古細菌基因組中,提供抵御質(zhì)粒和噬菌體等外來入侵遺傳元件的獲得性免疫,具有限制外源性遺傳物質(zhì)水平轉移的作用。插入序列(insertion sequence,IS)是染色體的特殊組成部分,是最簡單的高度可移動性轉座因子,可攜帶耐藥基因轉移,其在基因組中的插入可能使細菌基因產(chǎn)生突變從而影響細菌基因的正常表達。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)志賀菌Cas蛋白基因cse2中存在插入序列IS600,且插入序列IS600可使cse2 mRNA的表達水平降低,推測IS插入cas基因可能會影響Cas蛋白的功能進而影響Cascade蛋白復合物的結構及CRISPR/Cas系統(tǒng)的功能。為進一步研究插入序列對CRISPR/Cas系統(tǒng)的影響,結合課題組前期工作,本研究欲通過對cse2基因的生物信息學分析探索插入序列IS600對Cas蛋白及整個CRISPR/Cas系統(tǒng)的影響,進而為解決志賀菌的耐藥問題提供新思路。目的了解志賀菌中插入序列IS600在cse2基因中的的插入特點,分析其對cse2基因和Cse2蛋白的影響,并對cse2基因進行生物信息學分析。方法1.利用實驗室前期設計的引物PCR擴增志賀菌株的CRISPR相關蛋白基因cse2并將瓊脂糖凝膠電泳結果陽性條帶樣品送測序。2.應用Clustal X軟件和Blast在線比對(Global Align)對測序結果進行比對。3.應用ORF Finder和ExPASy的Translate tool翻譯并在線查找開放閱讀框。4.應用ProtParam工具和compute工具(計算等電點和分子量)在線分析蛋白理化性質(zhì);應用ProtScale軟件分析親水性、疏水性。5.應用TMHMM Server v.2.0進行跨膜區(qū)預測;應用Pfam 31.0程序和CDD軟件進行結構域預測。6.應用PredictProtein、SOPMA和PSIPRED進行二級結構的預測。7.應用SWISS-MODEL和PDBsum Generate分別進行三級結構的預測和預測模型的在線評估。結果1.39株志賀菌中,有2株細菌未檢出cse2基因,有12株細菌cse2基因條帶大小約為400bp,有25株細菌cse2基因條帶大小約為1600bp;基因擴增產(chǎn)物的測序結果與GenBank中宋內(nèi)志賀菌Ss046比對表明為目的基因cse2,且增加的1200bp通過測序確定為插入序列IS600的開放閱讀框序列。2.插入序列IS600插入cse2基因位置從第263個堿基開始,位于cse2基因的后半部分,插入序列IS600插入cse2基因的熱點為堿基TGC-GGC。3.菌株Ss046和菌株53G的cse2基因預測的開放閱讀框不同,連續(xù)翻譯的氨基酸序列不同,編碼的蛋白質(zhì)不同。4.菌株Ss046和菌株53G的Cse2蛋白的理化性質(zhì)如等電點和分子量、脂溶指數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、親水性和疏水性、氨基酸組成分布等都不相同。5.菌株Ss046和菌株53G兩者的Cse2蛋白整條肽鏈都位于細胞膜之外,不存在跨膜結構,不是跨膜蛋白;菌株Ss046的Cse2蛋白具有兩個結構域:HTH21(HTH-like domain)和rev(Integrase core domain),前者即HTH結構域,后者即整合酶核心領域;菌株53G的Cse2蛋白具有一個結構域:CRISPR Cse2。6.結合三種方法對菌株Ss046和菌株53G的Cse2蛋白二級結構預測的結果可知:α-螺旋和β-折疊散布于整個Cse2蛋白,成為蛋白的剛性支撐,無規(guī)則卷曲所占比例也較高,間雜少量的β-轉角。但兩菌株Cse2蛋白二級結構成分的比例都不同。7.Cse2蛋白三維同源結構建模顯示該蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成,與蛋白質(zhì)二級結構預測結果相符。從構建的三級結構模型結果來看,菌株Ss046和菌株53G的Cse2蛋白的三級結構存在明顯的差異。結論1.志賀菌中插入序列IS600在cse2基因中的插入存在熱點位置,為堿基TGCGGC,該位置易發(fā)生突變,調(diào)控cse2基因表達。2.志賀菌中插入序列IS600插入cse2基因后,使Cas蛋白的理化性質(zhì)、功能結構域以及二級結構、三級結構發(fā)生了變化,進而影響Cas蛋白的功能和Cascade復合物的結構以及整個CRISPR/Cas系統(tǒng)的功能。
[Abstract]:蹇楄春鑿屽睘閫氱О鐥㈢柧鏉嗚弻,鏄劅鏌撴，

本文編號：1872724