本文選題：志賀菌 + 插入序列�。� 參考：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：志賀菌屬通稱痢疾桿菌,是感染性腹瀉的常見致病菌之一,可引起細(xì)菌性痢疾。隨著各類抗生素在臨床的長期和廣泛使用,志賀氏菌的耐藥問題日益嚴(yán)重。耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer,HGT)是大多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性尤其是多重耐藥性的主要方式之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs),連同CRISPR相關(guān)基因(Cas)及其編碼的Cas蛋白共同組成CRISPR/Cas免疫系統(tǒng),它廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中,提供抵御質(zhì)粒和噬菌體等外來入侵遺傳元件的獲得性免疫,具有限制外源性遺傳物質(zhì)水平轉(zhuǎn)移的作用。插入序列(insertion sequence,IS)是染色體的特殊組成部分,是最簡單的高度可移動性轉(zhuǎn)座因子,可攜帶耐藥基因轉(zhuǎn)移,其在基因組中的插入可能使細(xì)菌基因產(chǎn)生突變從而影響細(xì)菌基因的正常表達(dá)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)志賀菌Cas蛋白基因cse2中存在插入序列IS600,且插入序列IS600可使cse2 mRNA的表達(dá)水平降低,推測IS插入cas基因可能會影響Cas蛋白的功能進(jìn)而影響Cascade蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及CRISPR/Cas系統(tǒng)的功能。為進(jìn)一步研究插入序列對CRISPR/Cas系統(tǒng)的影響,結(jié)合課題組前期工作,本研究欲通過對cse2基因的生物信息學(xué)分析探索插入序列IS600對Cas蛋白及整個CRISPR/Cas系統(tǒng)的影響,進(jìn)而為解決志賀菌的耐藥問題提供新思路。目的了解志賀菌中插入序列IS600在cse2基因中的的插入特點(diǎn),分析其對cse2基因和Cse2蛋白的影響,并對cse2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。方法1.利用實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計的引物PCR擴(kuò)增志賀菌株的CRISPR相關(guān)蛋白基因cse2并將瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果陽性條帶樣品送測序。2.應(yīng)用Clustal X軟件和Blast在線比對(Global Align)對測序結(jié)果進(jìn)行比對。3.應(yīng)用ORF Finder和ExPASy的Translate tool翻譯并在線查找開放閱讀框。4.應(yīng)用ProtParam工具和compute工具(計算等電點(diǎn)和分子量)在線分析蛋白理化性質(zhì);應(yīng)用ProtScale軟件分析親水性、疏水性。5.應(yīng)用TMHMM Server v.2.0進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測;應(yīng)用Pfam 31.0程序和CDD軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測。6.應(yīng)用PredictProtein、SOPMA和PSIPRED進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。7.應(yīng)用SWISS-MODEL和PDBsum Generate分別進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和預(yù)測模型的在線評估。結(jié)果1.39株志賀菌中,有2株細(xì)菌未檢出cse2基因,有12株細(xì)菌cse2基因條帶大小約為400bp,有25株細(xì)菌cse2基因條帶大小約為1600bp;基因擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果與GenBank中宋內(nèi)志賀菌Ss046比對表明為目的基因cse2,且增加的1200bp通過測序確定為插入序列IS600的開放閱讀框序列。2.插入序列IS600插入cse2基因位置從第263個堿基開始,位于cse2基因的后半部分,插入序列IS600插入cse2基因的熱點(diǎn)為堿基TGC-GGC。3.菌株Ss046和菌株53G的cse2基因預(yù)測的開放閱讀框不同,連續(xù)翻譯的氨基酸序列不同,編碼的蛋白質(zhì)不同。4.菌株Ss046和菌株53G的Cse2蛋白的理化性質(zhì)如等電點(diǎn)和分子量、脂溶指數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、親水性和疏水性、氨基酸組成分布等都不相同。5.菌株Ss046和菌株53G兩者的Cse2蛋白整條肽鏈都位于細(xì)胞膜之外,不存在跨膜結(jié)構(gòu),不是跨膜蛋白;菌株Ss046的Cse2蛋白具有兩個結(jié)構(gòu)域:HTH21(HTH-like domain)和rev(Integrase core domain),前者即HTH結(jié)構(gòu)域,后者即整合酶核心領(lǐng)域;菌株53G的Cse2蛋白具有一個結(jié)構(gòu)域:CRISPR Cse2。6.結(jié)合三種方法對菌株Ss046和菌株53G的Cse2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果可知:α-螺旋和β-折疊散布于整個Cse2蛋白,成為蛋白的剛性支撐,無規(guī)則卷曲所占比例也較高,間雜少量的β-轉(zhuǎn)角。但兩菌株Cse2蛋白二級結(jié)構(gòu)成分的比例都不同。7.Cse2蛋白三維同源結(jié)構(gòu)建模顯示該蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成,與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。從構(gòu)建的三級結(jié)構(gòu)模型結(jié)果來看,菌株Ss046和菌株53G的Cse2蛋白的三級結(jié)構(gòu)存在明顯的差異。結(jié)論1.志賀菌中插入序列IS600在cse2基因中的插入存在熱點(diǎn)位置,為堿基TGCGGC,該位置易發(fā)生突變,調(diào)控cse2基因表達(dá)。2.志賀菌中插入序列IS600插入cse2基因后,使Cas蛋白的理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)域以及二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,進(jìn)而影響Cas蛋白的功能和Cascade復(fù)合物的結(jié)構(gòu)以及整個CRISPR/Cas系統(tǒng)的功能。
[Abstract]:蹇楄春鑿屽睘閫氱О鐥㈢柧鏉嗚弻,鏄劅鏌撴，

本文編號：1872724