本文選題：人胚胎干細胞 + 神經嵴細胞�。� 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景:人胚胎干細胞(human embryonic stem cells,hESCs)是從囊胚內細胞團(inner cell mass,ICM)中分離培養(yǎng)得到的一類具有亞全能分化能力的干細胞,具有自發(fā)向三胚層來源細胞分化的潛能[1],并能向特定方向誘導分化,因此hESCs在基因治療、組織工程學和藥學研究等眾多領域具有廣泛的應用價值[2]。神經嵴細胞(neural crest cells,NCCs)是脊椎動物胚胎發(fā)育過程中短暫存在的一類多能細胞群。在早期胚胎發(fā)育過程中,NCCs出現在神經管隆起的神經褶,而后廣泛遷移到各處[3],在環(huán)境的作用下可向內、中、外三個胚層分化成多種細胞類型,包括感覺神經元、骨細胞、軟骨細胞、色素細胞、腎上腺髓質細胞以及平滑肌細胞等[4]。由于NCCs可以分化發(fā)育成顱面部絕大部分骨、軟骨以及結締組織結構,因此NCCs可以作為體外研究胚胎早期顱面發(fā)育過程和機制的細胞模型。ALX基因家族屬于同源框基因中PRD家族中的一個亞家族,該基因家族成員包括ALX1(Cart1)、ALX3和ALX4[5]。研究發(fā)現,該家族成員的突變會引起一種特殊的顱面部發(fā)育畸形——鼻額發(fā)育不良(Frontonasal dysplasia,FND)[6]。許多研究表明ALX基因家族在顱面部發(fā)育中起著重要的作用。但是目前ALX基因家族成員在各種細胞的表達水平和功能都尚不明確。研究目的:1.獲取H9hESCs來源NCCs(H9-NCCs)并鑒定其生物學特性2.明確ALX家族基因在H9-NCCs及其來源分化細胞中的表達水平3.明確ALX基因家族成員對H9-NCCs的生物學特性的影響研究方法和結果:1.H9 hESCs來源NCCs的獲取、培養(yǎng)和鑒定方法:利用體外同時添加Wnt通路激活劑和Smad通路抑制劑的方法將H9 hESCs誘導分化形成NCCs(H9-NCCs),觀察H9hESCs及H9-NCCs的細胞形態(tài),并通過免疫熒光染色和Real-time PCR方法鑒定H9 hESCs及其來源的H9-NCCs的特定標志物的表達。通過添加成神經和成間充質干細胞誘導分化液將H9-NCCs分別誘導分化成外胚層來源的外周神經細胞和中胚層來源的間充質干細胞(MSCs)并對得到的MSCs進行成骨成脂誘導分化,檢測H9-NCCs的多向分化能力。結果:H9hESCs呈克隆樣生長,邊界光滑,結構致密。在誘導7天左右有菱形細胞從H9 hESCs細胞克隆邊緣爬出,細胞在3-4天左右融合,標記為P0代H9-NCCs;Real-time PCR檢測P4代H9-NCCs標志物的表達結果顯示與hESCs相比,H9-NCCs 高表達 NCCs 標志基因 SOX9、SOX10、P75、HNK-1、AP2 和ZIC1,而低表達hESCs的標志基因NANOG和OCT4。免疫熒光染色結果顯示H9-NCCs高表達NCCs標志物蛋白HNK-1和P75。體外成神經誘導分化14天后,H9-NCCs細胞變長,可觀察到神經纖維狀突起的形成。免疫熒光染色結果顯示,分化得到的細胞高表達外周神經元標志物β-tubulin III和peripherin。H9-NCCs在MSCs分化誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天后可觀察到細胞從NCCs的菱形轉變成MSCs樣的長梭形,流式細胞分析結果顯示,H9-NCCs來源MSCs(H9-NCC-MSCs)高表達MSCs表面標志物CD90,CD105,CD73和CD44,不表達造血干細胞標志物CD34、CD116、CD19、CD45和HLA-DR。此外,H9-NCC-MSCs成骨誘導分化14天后經茜素紅染色可觀察到深紅色鈣結節(jié)存在,但成脂分化14天后油紅O染色未見脂滴形成。2.ALX家族基因在H9hESCs,H9-NCCs及其來源分化細胞中的表達水平方法:Real-time PCR 檢測 H9 hESCs、H9-NCCs、外周神經細胞、H9-NCC-MSCs及其來源成骨細胞中ALX1、ALX3和ALX4的表達水平。結果:在H9hESCs和H9-NCCs中,ALX家族基因表達量并沒有明顯差異,但ALX1在H9-NCCs中的表達量顯著高于在H9-NCC-MSCs及其分化得到的成骨細胞中。ALX3和ALX4在表達模式上具有相似性,ALX3在H9-NCC-MSCs特異性的高表達,而ALX4在外周神經細胞和H9-NCC-MSCs及其分化得到的成骨細胞中均高表達。3.過表達ALX家族基因對H9-NCCs的生物學特性的影響方法:構建過表達ALX家族基因(ALX1,ALX3,ALX4)的慢病毒載體轉染293T細胞并收集病毒感染H9-NCCs,檢測過表達ALX家族基因對H9-NCCs生物學特性的影響;利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測細胞增殖能力;利用Annexin V/7-AAD染色和流式細胞分析檢測細胞凋亡水平;采用Transwell法和結晶紫染色檢測H9-NCCs的遷移能力。結果:ALX家族基因與H9-NCCs的增殖能力、遷移能力和凋亡水平有關。過表達ALX1,ALX3和ALX4均可顯著提高H9-NCCs的遷移能力。此外,過表達ALX1還可顯著提高H9-NCCs的增殖能力;而過表達ALX4可顯著降低H9-NCCs的增殖能力并且提高其凋亡水平。研究結論:1.H9-hESCs經體外誘導分化形成的H9-NCCs具有NCCs的細胞形態(tài)并表達NCCs特定標志物,且具有向神經細胞和間充質細胞方向分化的潛能,提示H9-hESCs經體外誘導分化形成的H9-NCCs具有NCCs生物學特性。2.不同的ALX基因在不同分化階段的細胞中有不同的表達譜,提示他們在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮的功能具有時序性和空間性。3.ALX基因家族成員(ALX1,ALX3和ALX4)對H9-NCCs的遷移能力起重要的調控作用,且三者在功能上具有重疊和不同之處。過表達ALX1,ALX3和ALX4均可顯著提高H9-NCCs的遷移能力,并且ALX1和ALX4表達水平還與細胞的增殖能力有關;ALX1過表達促進H9-NCCs的增殖,而ALX4過表達可抑制H9-NCCs增殖并促進凋亡。
[Abstract]:BACKGROUND : Human embryonic stem cells ( hESCs ) are derived from the inner cell mass ( ICM ) of human embryonic stem cells ( ICM ) . It has the potential to differentiate into three - embryonic stem cells and induce differentiation in a specific direction . Therefore , hESCs has a wide application value in gene therapy , tissue engineering and pharmaceutical research . The neural crest cells ( NCCs ) are a kind of multi - cell group which is transiently present in the development of vertebrate embryos . During the early embryo development , NCCs appear in the neural folds of the neural tube and migrate widely to every place . In the environment , the three embryonic layers can be differentiated into a variety of cell types , including sensory neurons , osteocytes , chondrocytes , pigment cells , adrenomedullar cells and smooth muscle cells . Since NCCs can differentiate into the vast majority of bone , cartilage and connective tissue structures , the NCCs can be used as a cellular model for studying the process and mechanism of early embryonic development of embryos in vitro . The ALX gene family belongs to a subfamily of the PRD families in homeobox genes , and the family members include ALX1 ( Cart1 ) , ALX3 and ALX4 . It has been found that mutations in the family members may cause a special head - facial dysplasia _ ( FND ) deformity . The expression levels and functions of ALX gene family members in the differentiation of H9 - NCCs were determined by immunofluorescence staining and Real - time PCR . The expression levels of ALX1 , ALX3 and ALX4 in hESCs and H9 - NCCs were significantly higher than that of H9 - NCC - MSCs .

【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R329.2

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