本文選題：CRISPR/dCas9 + 過表達(dá)��； 參考：《西南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：自身免疫性疾病(Autoimmune disease,AID)的特點是免疫細(xì)胞對健康細(xì)胞和正常組織產(chǎn)生異常的免疫產(chǎn)生排斥反應(yīng),而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+T細(xì)胞)作為成熟T細(xì)胞的一個亞類群,在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)和預(yù)防自身免疫性疾病過程中發(fā)揮著重要作用。除此之外,大量研究表明,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能異�？赡苁侨祟愖陨砻庖咝约膊“l(fā)生根本原因之一。如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、伴X染色體的性聯(lián)免疫缺陷綜合癥(IPEX syndrome)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA),以及許多其它自身免疫性疾病都與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能失常相關(guān)。Foxp3,作為叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分子標(biāo)志性基因。已有研究表明,Foxp3基因在胸腺和外周調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中都呈現(xiàn)高水平表達(dá),該基因敲除會導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育障礙,最終導(dǎo)致嚴(yán)重的自身免疫性疾病。由此可見,Foxp3基因在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和功能維持上是必需的。去活化的Cas9系統(tǒng)(dCas9)是通過誘導(dǎo)Cas9核酸酶的RuvC和HNH兩個結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列發(fā)生突變,進(jìn)而使其失去活性實現(xiàn)的,dCas9雖然具有結(jié)合DNA的能力,但不能編輯DNA。dCas9系統(tǒng)分別融合一個激活元件或抑制元件,可以實現(xiàn)sgRNA介導(dǎo)的靶基因的激活或者抑制,進(jìn)而產(chǎn)生兩種截然不同的功能。CRISPR-Cas9-Pumilioio系統(tǒng)(簡稱Casilio系統(tǒng)),通過組合CRISPR-dCas9、Pumilio RNA結(jié)合蛋白-效應(yīng)因子和攜帶一個或多個PUF結(jié)合位點的sgRNA(sgRNA-PBS),進(jìn)而可實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,表觀遺傳修飾蛋白及熒光蛋白在基因組靶位點上的多聚化。而傳統(tǒng)型CRISPR-dCas9系統(tǒng)相對簡單,僅通過構(gòu)建cas9和效應(yīng)因子的融合蛋白實現(xiàn)的。本研究在不同細(xì)胞系中,創(chuàng)新性地使用CRISPR-Cas9-Pumilio系統(tǒng)(Casilio系統(tǒng))和傳統(tǒng)的過表達(dá)方法,從外源和內(nèi)源激活兩個方面,系統(tǒng)地比較研究了Foxp3基因激活的效率,最終揭示人外周血原代培養(yǎng)T細(xì)胞中Foxp3基因激活誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化的可行性。本論文的研究結(jié)果歸納如下:1)首先,在HEK293T細(xì)胞系(人腎上皮細(xì)胞系)中通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行Oct4基因激活實驗,驗證了傳統(tǒng)CRISPR-dCas9和Casilio基因編輯系統(tǒng)的可行性和穩(wěn)定性,并對系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)。Real-time PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),Casilio基因編輯系統(tǒng)對Oct4基因的激活效率明顯高于傳統(tǒng)CRISPR-dCas9系統(tǒng)。而有趣的是,二者高效作用元件混合系統(tǒng)的激活效應(yīng)要比Casilio基因編輯系統(tǒng)更加優(yōu)越�？傊�,混合系統(tǒng)的激活效率Casilio基因編輯系統(tǒng)CRISPR-dCas9基因編輯系統(tǒng)。該結(jié)果為后續(xù)實驗的開展奠定了基礎(chǔ),并為其提供了良好的技術(shù)支持。2)用上述基因激活系統(tǒng)在HEK293T細(xì)胞系嘗試Foxp3基因的激活實驗,并通過Real-time PCR檢測Foxp3基因表達(dá)水平變化。Foxp3基因激活的效果與Oct4基因的激活趨勢一致,即混合系統(tǒng)的激活效率Casilio基因編輯系統(tǒng)CRISPR-dCas9基因編輯系統(tǒng),這說明在HEK293T細(xì)胞系中,這些系統(tǒng)對基因的激活效率是穩(wěn)定的。該研究為Foxp3基因在其它細(xì)胞系的激活篩選到了特異性強(qiáng),激活效率高的候選sgRNA系統(tǒng)。3)Jurkat細(xì)胞系(人外周血白血病T細(xì)胞)屬于CD4 T細(xì)胞,可以穩(wěn)定地進(jìn)行體外培養(yǎng)和傳代,研究中一般作為T細(xì)胞模型。根據(jù)HEK293T細(xì)胞的研究結(jié)果,將已構(gòu)建的Foxp3基因的過表達(dá)系統(tǒng)(sgRNA),通過病毒包裝感染Jurkat細(xì)胞系檢測在HEK293T細(xì)胞系中穩(wěn)定工作的三個系統(tǒng)在T細(xì)胞系對Foxp3基因的激活效率和穩(wěn)定性。通過Real-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)十分顯著的激活效果,實驗組的Foxp3基因表達(dá)水平顯著提高。4)通過與醫(yī)院建立合作,獲得少量人外周血并分離得到單核細(xì)胞(PBMC),進(jìn)一步分離得到了原代T細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。同樣用Foxp3基因的過表達(dá)系統(tǒng),感染原代培養(yǎng)的T細(xì)胞,研究Foxp3基因的表達(dá)水平變化和原代培養(yǎng)的T細(xì)胞分化方向和命運改變。結(jié)果顯示,混合系統(tǒng)能夠顯著提高Foxp3基因的表達(dá)。增殖抑制實驗表明,所得細(xì)胞群能夠抑制CD4+CD25-細(xì)胞的增殖,這說明所得細(xì)胞具有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能特征之一(增殖抑制)。綜上所述,我們通過大量的實驗檢測了CRISPR/Cas9基因激活和EF1α介導(dǎo)在不同細(xì)胞系對Foxp3基因的激活效率和穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn),通過激活效果最優(yōu)的基因激活系統(tǒng)和過表達(dá)的方法,在人的原代培養(yǎng)T細(xì)胞中獲得了高水平表達(dá)Foxp3基因和具有增殖抑制功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。本研究為進(jìn)一步高效誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化體系的優(yōu)化奠定了堅實的基礎(chǔ),今后我們實驗的工作重點是探索在原代培養(yǎng)T細(xì)胞中,嘗試幾種基因激活系統(tǒng)的不同組合,不斷優(yōu)化各項指標(biāo),以期獲得誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化的最優(yōu)化條件。進(jìn)而為以后自身免疫疾病的治療研究奠定基礎(chǔ),為減輕自身免疫疾病患者的痛苦做出貢獻(xiàn)。
[Abstract]:This study shows that Foxp3 gene plays an important role in the development and function of regulatory T cells . In this study , the expression level of Foxp3 gene and the expression level of Foxp3 gene were determined by real - time PCR and flow cytometry .

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R593.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 毛海燕;盧桂玲;;轉(zhuǎn)錄因子FOXP3與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志;2008年04期

2 曹新國;王禮文;;人類免疫調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子FOXP3研究進(jìn)展[J];臨床檢驗雜志;2006年01期

，

本文編號：1867653