本文選題：煙草 + acdS基因�。� 參考：《鄭州大學》2017年碩士論文

【摘要】：煙草是我國重要的經(jīng)濟作物,土地鹽堿化引起的土壤板結、利用率低等問題一直制約著煙草在鹽堿地上的種植。植物受逆境脅迫時,乙稀含量升高且過量的乙稀會抑制植物生長并對植物造成損害。ACC氧化酶(ACO)能氧化ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)從而生成乙稀,而acdS基因編碼的ACC脫氨酶(ACD)能通過水解ACC,降低植物體內(nèi)乙稀的合成,有效緩解高濃度乙稀對植物生長的抑制作用,促進植物生長。實驗室前期研究結果顯示海濱錦葵內(nèi)生細菌蠟樣芽孢桿菌HK012(Bacillus cereus HK012),具有較高ACC脫氨酶活性,接種于小麥等作物根系后,能顯著增強這些植物在高鹽脅迫下的抗性。基于上述研究結果,本文采用葉盤法將蠟樣芽孢桿菌HK012的acdS基因轉入煙草,獲得基因工程耐鹽煙草新品種,為提高煙草對鹽堿地的利用率提供理論基礎和技術支持。論文從蠟樣芽孢桿菌HK012中克隆acdS基因,利用Gateway技術構建植物pMDC 45-acdS(2×35S-GFP-acdS-Nos)表達載體,并通過葉盤法將其轉入煙草中,根據(jù)重組質粒攜帶的篩選標記基因Hyg,用潮霉素濃度為15 mg/L的愈傷培養(yǎng)基(MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+500 mg/L Cefotaxime)進行煙草不定芽的篩選,潮霉素濃度為10 mg/L的生根培養(yǎng)基(MS+250 mg/L Cefotaxime)進一步篩選轉基因苗,獲得轉基因株。通過DNA水平、mRAN水平以及蛋白質表達水平(Western blot)檢驗,表明acdS融合基因在煙草中獲得穩(wěn)定表達,熒光顯微鏡觀測顯示融合蛋白定位于煙草根系的細胞膜(或細胞壁)上。對轉基因煙草T2代幼苗進行耐鹽性檢測,實驗結果表明轉基因煙草株高、根長、干重、鮮重、葉綠素含量均大于未轉化煙草。脯氨酸含量測定結果顯示,150 mM NaCl、300 mM NaCl濃度下轉基因煙草葉片中脯氨酸含量相對于未轉化煙草分別提高55.15%、42.70%。保護酶(SOD、POD、CAT)活性測定結果顯示,當NaCl濃度為150 mM時,轉基因煙草SOD、POD、CAT活性相對于未轉化煙草分別提高28.87%、21.57%、21.84%;當NaCl濃度為300 mM時,轉基因煙草SOD、POD、CAT活性相對于未轉化煙草分別提高31.83%、32.24%、26.30%。ACC脫氨酶活性測定結果顯示,轉基因煙草ACC脫氨酶活性均大于未轉化煙草,在150 mM NaCl、300 mM NaCl濃度下轉基因煙草葉片中ACC脫氨酶活性相對于未轉化煙草分別提高15.3%、58.1%。綜合以上實驗結果表明蠟樣芽孢桿菌acdS基因成功轉入煙草并獲得穩(wěn)定表達,從而提高了煙草在高鹽脅迫下的抗性。另一方面表明,acdS基因在植物耐鹽基因工程中具有一定應用價值,通過基因工程方法開發(fā)新基因改良煙草品種有望提高煙草對鹽堿土地的利用率。
[Abstract]:Tobacco is an important cash crop in China. The problems of soil consolidation caused by soil salinization and low utilization rate have been restricting the cultivation of tobacco on saline soil. When plants are stressed by stress, ethylene content increases and excess ethylene inhibits plant growth and causes damage to plants. ACC oxidase ACO) can oxidize ACC-1-aminocyclopropane-1-carboxylate) to produce ethylene. ACC deaminase (ACD) encoded by acdS gene can reduce the synthesis of ethylene in plants by hydrolyzing ACCs, alleviate the inhibitory effect of high concentration ethylenes on plant growth and promote plant growth. The experimental results showed that the endophytic Bacillus cereus HK012(Bacillus cereus HK012 had high ACC deaminase activity. Inoculation with wheat roots could significantly enhance the resistance of these plants under high salt stress. Based on the above results, the acdS gene of Bacillus cereus HK012 was transferred to tobacco by leaf disk method, and a new genetic engineering salt-tolerant tobacco variety was obtained, which provided the theoretical basis and technical support for improving the utilization rate of tobacco to saline-alkali soil. In this paper, acdS gene was cloned from Bacillus cereus HK012, and the expression vector of plant pMDC 45-acdS(2 脳 35S-GFP-acdS-Nosin was constructed by Gateway technique and transferred into tobacco by leaf disk method. According to the screening marker gene Hyg carried by the recombinant plasmid, the adventitious buds of tobacco were screened on the callus medium MS 1 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA 500 mg/L Cefotaxime with hygromycin concentration of 15 mg/L. The transgenic seedlings were further screened on the rooting medium MS 250 mg/L Cefotaxime with the concentration of hygromycin for 10 mg/L, and the transgenic plants were obtained. AcdS fusion gene was stably expressed in tobacco by DNA level and protein expression level. Fluorescence microscopy showed that the fusion protein was located on the cell membrane (or cell wall) of tobacco root system. The salt tolerance of transgenic tobacco seedlings of generation T2 was tested. The results showed that the height, root length, dry weight, fresh weight and chlorophyll content of transgenic tobacco were higher than those of untransformed tobacco. The results of proline content measurement showed that the proline content in transgenic tobacco leaves increased 55.15% and 42.70%, respectively, compared with untransformed tobacco at the concentration of 150mm NaCl-300mm NaCl. When the concentration of NaCl was 150 mm, the cat activity of transgenic tobacco was increased by 28.87% and 21.57 mm than that of untransformed tobacco, respectively, and when the concentration of NaCl was 300mm, the activity of cat in transgenic tobacco was increased by 28.87 mm and 21.57 mm, respectively, when the concentration of NaCl was 300mm. Compared with untransformed tobacco, the activity of cat in transgenic tobacco was increased by 31.833,32.24 and 26.30.ACC deaminase activity. The results showed that the activity of ACC deaminase in transgenic tobacco was higher than that in untransformed tobacco. The activity of ACC deaminase in transgenic tobacco leaves was increased by 15.3% compared with that of untransformed tobacco at the concentration of 150mm NaCl-300mm NaCl, respectively. The results showed that the acdS gene of Bacillus cereus was successfully transformed into tobacco and expressed stably, which improved the resistance of tobacco under high salt stress. On the other hand, it is suggested that the acdS gene has certain application value in plant salt tolerance gene engineering, and it is expected to improve the utilization rate of saline-alkali land by developing new genetic modified tobacco varieties by genetic engineering method.
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S572

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