本文選題：骨肉瘤 + miR-664��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤,是來源于胚胎間葉組織的惡性程度很高的實(shí)體性腫瘤。大多數(shù)骨肉瘤為原發(fā)性腫瘤,只有少部分為繼發(fā)性,好發(fā)部位位于血運(yùn)豐富的四肢骨的干骺端,以下肢股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端最常見,其次是肱骨和腓骨近端。骨肉瘤多為溶骨性改變,少數(shù)為成骨性改變,骨肉瘤組織中含有不同成分的骨軟骨、纖維結(jié)締組織及增生骨樣骨組織。骨肉瘤病理學(xué)特點(diǎn)是腫瘤組織能產(chǎn)生高度惡性梭形基質(zhì)細(xì)胞,并形成骨樣組織,腫瘤細(xì)胞還可以直接成骨和產(chǎn)生骨基質(zhì),可浸潤擴(kuò)散至骨皮質(zhì)及髓腔。目前也有新的研究表明,骨肉瘤的惡性腫瘤細(xì)胞并非完全來自于骨基質(zhì)細(xì)胞,骨間質(zhì)的多能干細(xì)胞惡性增殖也能導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生。骨肉瘤發(fā)病率在原發(fā)性惡性骨腫瘤中占據(jù)首位,骨肉瘤發(fā)病年齡多在15～25歲,發(fā)病率為4.5/100萬,在美國每年新發(fā)的骨肉瘤患者約為900例。骨肉瘤多早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而且發(fā)展迅速,其轉(zhuǎn)移率及病死率非常高。單純行截肢治療或行保肢手術(shù)及腫瘤型假體置換手術(shù)無法有效控制腫瘤的轉(zhuǎn)移,患者常在短期內(nèi)死于腫瘤肺轉(zhuǎn)移,如何治療骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移成為骨肉瘤治療中面臨最重要問題之一。隨著治療手段的不斷提高,目前采用新輔助化療加保肢手術(shù)等綜合性治療已經(jīng)成為治療骨肉瘤的主要方式,可有效提高患者的短期生存率,對(duì)骨肉瘤的治療已經(jīng)取得了明顯進(jìn)步。美國癌癥中心的數(shù)據(jù)顯示骨肉瘤患者的5年生存率平均約為53.9%,隨著手術(shù)及新輔助化療等技術(shù)的快速發(fā)展,未發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年生存率提高到70%左右,但對(duì)骨肉瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等問題仍然沒有得到有效解決,伴有肺部轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者短期生存率沒有明顯提高。很大部分骨肉瘤患者,在初步診斷為骨肉瘤時(shí),已經(jīng)在肺部發(fā)生了無癥狀或者癥狀輕微(僅表現(xiàn)為不明原因咳嗽)的轉(zhuǎn)移,其他部分轉(zhuǎn)移如肝,腎等部位轉(zhuǎn)移普遍存在。任何類型的腫瘤,包括骨肉瘤一旦發(fā)生遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移,意味著預(yù)后不佳,即便多手段聯(lián)合治療,患者的其5年生存率不會(huì)高于30%。骨肉瘤對(duì)患者本人、家庭乃至社會(huì)造成巨大的痛苦及經(jīng)濟(jì)壓力。雖然越來越多的治療開始向分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方面靠近,從基因及干細(xì)胞角度去嘗試治療腫瘤病變是將來醫(yī)學(xué)的發(fā)展方向。目前腫瘤的治療包括介入治療、免疫治療、干細(xì)胞移植等多中手段,為惡性腫瘤的治療提供了可靠而安全的治療。相比過去盡管骨肉瘤的治療取得了長足的進(jìn)步,但是仍然沒有取得理想的突破性進(jìn)展。在其治療中仍然存在許多難以解決的問題,如中晚期遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移、腫瘤原發(fā)病灶再發(fā)性和轉(zhuǎn)移性骨腫瘤尚無療效樂觀的的靶向治療方式。如何實(shí)現(xiàn)骨肉瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療及預(yù)防骨肉瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)鍵性意義。因此盡早發(fā)現(xiàn)骨肉瘤及預(yù)防其惡性增殖成為目前尚需迫切解決的問題。由于正常細(xì)胞原癌基因突變?yōu)榘┗?腫瘤細(xì)胞獲得了理論上無限增殖的能力。腫瘤的惡性增殖直接導(dǎo)致了腫瘤切除后局部殘留或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞再度增殖復(fù)發(fā)的可能,臨床上對(duì)此尚無理想的對(duì)策。研究表明腫瘤的產(chǎn)生不是一蹴而就的簡單過程。細(xì)胞的單克隆學(xué)說理論中指出,一旦細(xì)胞發(fā)生基因的點(diǎn)突變或者缺失突變后,極易導(dǎo)致原癌細(xì)胞的癌變,細(xì)胞不僅僅獲得分裂的能力,同時(shí)獲得了分裂速度的質(zhì)變。當(dāng)外周環(huán)境包括內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境條件合適,營養(yǎng)充分的條件下,腫瘤細(xì)胞可以突破本身局限,向周圍組織侵犯和轉(zhuǎn)移,實(shí)現(xiàn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。很多轉(zhuǎn)移性腫瘤不一定能找到原發(fā)病灶,臨床上稱之為“微小轉(zhuǎn)移癌”,指的就是微小細(xì)胞組成的癌團(tuán),轉(zhuǎn)移侵犯往往大于增殖速度,導(dǎo)致腫瘤薄膜不明顯,局部無特征性影像學(xué)改變。研究者嘗試從分子及基因角度去闡明腫瘤增殖的機(jī)制,試圖尋找腫瘤增殖的分子標(biāo)記物以及治療靶標(biāo),特別是在外周體液及血液中能夠檢測(cè)出的分子標(biāo)記物,為早期治療、早期預(yù)防提供有效而快捷的途徑,也是目前腫瘤研究的最大難題之一。S期細(xì)胞分裂周期縮短,分裂時(shí)象增加,G1期細(xì)胞分裂周期延長,分裂時(shí)象減少,G1/S比例倒置以及細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)失平衡,是腫瘤細(xì)胞增殖分裂的細(xì)胞學(xué)特征。主要分子機(jī)制是促癌基因及蛋白表達(dá)增加,比如周期蛋白CyclinD1,CyclinA等,而有抑癌作用的基因及蛋白表達(dá)含量降低,比如周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21家族。如何控制細(xì)胞增殖,調(diào)控細(xì)胞G1/S分裂速度,并維持細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)平衡是治療腫瘤的關(guān)鍵。越來越多的研究關(guān)注與細(xì)胞增殖事件所涉及到的基因、分子通路,并努力尋找腫瘤標(biāo)記物,便于臨床診斷治療。因此闡明調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖事件的分子機(jī)制,探尋引起細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的原因,甚至尋找阻斷腫瘤增殖發(fā)生的靶位點(diǎn),將對(duì)于多種惡性腫瘤預(yù)防和藥物研制具有重要指導(dǎo)意義。MicroRNA (miRNA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類約20-25nt的非編碼小RNA分子。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),miRNA參與生物多種重要生命活動(dòng)：調(diào)控細(xì)胞生長、分化、增殖、粘附、監(jiān)視、凋亡；調(diào)節(jié)組織構(gòu)造、平衡、識(shí)別。miRNA被譽(yù)為是“生物學(xué)中的暗物質(zhì),存在于我們周圍卻幾乎逃脫了所有的視線”,中心法則中RNA已經(jīng)不是次要的中介角色。MicroRNA可通過與靶基因mRNA結(jié)節(jié)調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄水平。人類遺產(chǎn)基因庫已發(fā)現(xiàn)1000余種人體相關(guān)miRNA。 miRNA在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守,在植物、動(dòng)物和真菌中發(fā)現(xiàn)的miRNA只在特定的組織和發(fā)育階段表達(dá),miRNA的組織特異性和時(shí)序性,決定組織和細(xì)胞的功能特異性,表明miRNA在細(xì)胞生長和發(fā)育過程中起多種調(diào)節(jié)作用。大多數(shù)miRNA的基因位于非編碼區(qū),只有少數(shù)位于編碼區(qū),一般獨(dú)立存在,少部分成簇狀排列,簇狀排列的多個(gè)基因具有協(xié)同表達(dá)的特點(diǎn)。miRNA與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。miRNA既可作為癌基因,下調(diào)抑癌基因的活性；也可作為抑癌基因,下調(diào)原癌基因的活性。Esquela-Kerscher總結(jié)既往和現(xiàn)有腫瘤相關(guān)miRNA的研究,認(rèn)為miRNA與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān),并提出"oncology microRNAs"(腫瘤MicroRNA)的新概念,開辟了將miRNA應(yīng)用于腫瘤學(xué)相關(guān)研究的新篇章。多種miRNA的突變或含量變化與惡性骨腫瘤骨肉瘤的發(fā)生、惡化及遷徙密切相關(guān)。插頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXO)能夠抑制腫瘤生長、限制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,FOXO表達(dá)與人類癌癥如橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、白血病和淋巴瘤等相關(guān)。phosphatidylinositol-3激酶通路中FOXO相關(guān)蛋白質(zhì)滅活是主要致癌信號(hào),多種miRNA通過抑制FOXO基因?qū)е录?xì)胞癌變。FOXO做為抑癌因子能夠?yàn)槟[瘤帶來新的治療方法,FOXO的下游靶基因是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(PKB)/ Akt蛋白激酶能夠抑制轉(zhuǎn)錄功能調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、生長和增殖,可為腫瘤帶來新的治療方法。新證據(jù)表明FOXO參與不同的胞內(nèi)信號(hào)通路并可能是許多生理和病理狀態(tài)包括癌癥的關(guān)鍵角色,FOXO與這些信號(hào)通路交互影響,并參與其他胞內(nèi)蛋白磷酸化及轉(zhuǎn)錄后修飾。FOXO通過誘導(dǎo)表達(dá)多個(gè)促癌Bcl2-family成員積極參與線粒體靶向蛋白刺激死亡受體配體如Fas配體和腫瘤壞死factor-related凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL),或提高水平的各種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKIs),抑制細(xì)胞生長和/或促進(jìn)細(xì)胞凋亡。FOXO表達(dá)譜已被確定在數(shù)種人類癌癥存在,并認(rèn)為具有分子治療的潛力。本研究將尋找與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性很高的miRNA作為研究對(duì)象,探尋其在癌癥形成過程中的促癌或者抑癌作用,并嘗試分析其靶基因及作用機(jī)理。目前有文章報(bào)道m(xù)iR-664高表達(dá)于肝癌組織中且在肝癌中與MATA的表達(dá)相關(guān)。miR-664在乳頭狀甲狀腺癌的淋巴結(jié)樣本中低表達(dá),miR-664心肌損傷病人中高表達(dá)。且這些研究僅僅是檢測(cè)樣本表達(dá)的情況,并沒有對(duì)其功能及具體作用機(jī)制做出詳細(xì)的探討。我們?cè)谛酒脚_(tái)的GSE39040芯片發(fā)現(xiàn)miR-664異常表達(dá)于骨肉瘤中,并通過Targetscan數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),并將預(yù)測(cè)結(jié)果輸入軟件進(jìn)行生物學(xué)通路分析,發(fā)現(xiàn)miR-664與FOXO4基因存在強(qiáng)相關(guān)性。以上僅僅為理論上猜測(cè),MiR-664在骨肉瘤中的表達(dá)水平及其生物作用機(jī)制目前沒有任何的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本課題在前期MicroRNA表達(dá)譜通過生物網(wǎng)絡(luò)信息學(xué)方法,預(yù)測(cè)miR-664在骨肉瘤組織中過表達(dá)的基礎(chǔ)上,以轉(zhuǎn)染rniR-664 mimic、miR-664 inhibitor骨肉瘤細(xì)胞為模型,通過研究miR-664誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,探討miR-664下調(diào)FOX04激活PI3K/AKT/FOXO信號(hào)通路從而調(diào)節(jié)p21, CyclinD1等信號(hào)分子的變化。通過驗(yàn)證過表達(dá)miR-664通過靶向結(jié)合FOXO4的3'UTR抑制FOXO4的翻譯,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞快速增殖的假設(shè)提供直接證據(jù)及為治療骨肉瘤提供新的分子靶點(diǎn)。本研究將分成三部分研究miR-664與骨肉瘤的相關(guān)性及下調(diào)FOXO4基因促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖的機(jī)制。第一部分miR-664在骨肉瘤中的異常表達(dá)(一)miR-664在人體骨肉瘤病理組織中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模候?yàn)證miR-664在人體骨肉瘤病理組織中的表達(dá)量實(shí)驗(yàn)方法：采集8例人體骨肉瘤病理組織和癌旁病理組織,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,采用Sybrgreen染料法,以U6為內(nèi)參基因,對(duì)miR-664基因在人體骨肉瘤新鮮病理組織及及癌旁組織中的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：8例骨肉瘤組織中miR-664相對(duì)于U6的平均表達(dá)水平為1.807,8例骨肉瘤癌旁組織中的miR-664相對(duì)于U6的平均表達(dá)水平為0.038,相差47.55倍(p0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：miR-664在骨肉瘤病理組織中高表達(dá)。(二)miR-664在體外骨肉瘤細(xì)胞株中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模候?yàn)證miR-664在人體骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)量實(shí)驗(yàn)方法：通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,采用Sybrgreen染料法,以U6為內(nèi)參基因,對(duì)miR-664基因在SOSP-9607、U2-OS、SAOS-2、HOS、MG-63及人正常成骨細(xì)胞株hFOB1.19的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：相較于對(duì)照組hFOB1.19細(xì)胞株,miR-664在5種骨肉瘤細(xì)胞株中均特異性地表達(dá)上調(diào)(P0.05),其中以MG-63(26.383)最高,SAOS-2(19.343)次之,U2-OS (16.553) HOS (11.577)居中,SOSP-9607 (9.633)最低。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：miR-664在5組體外骨肉瘤細(xì)胞中均呈高表達(dá),并根據(jù)5組骨肉瘤細(xì)胞株的miR-664的表達(dá),選取U2-OS骨肉瘤株作為轉(zhuǎn)染對(duì)象及實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。第二部分miR-664表達(dá)失調(diào)對(duì)U2-OS骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖的影響(一)過表達(dá)miR-664促進(jìn)U2-OS骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯窟^表達(dá)miR-664對(duì)于U2-OS骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖的影響。實(shí)驗(yàn)方法：以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-664 mimic及NC對(duì)照的U2-OS骨肉瘤細(xì)胞為模型,通過1、實(shí)時(shí)熒光免疫PCR檢測(cè)miR-664 mimic瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞miR-664的表達(dá)；2、MTT比色法技術(shù)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞增殖速度；3、細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力；4、軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)(Soft agar assay)檢測(cè)癌細(xì)胞非錨定生長的惡性化能力；5、BrdU滲入法(5-溴脫氧尿嘧啶核苷法)技術(shù)檢測(cè)miR-664對(duì)細(xì)胞分裂周期的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、轉(zhuǎn)染miR-664 mimic后,miR-664的表達(dá)增高了16.192倍(P0.05)；2、MTT比色法實(shí)驗(yàn)：miR-664 mimic組骨肉瘤細(xì)胞增殖速度(10.822)明顯高于對(duì)照組(P0.05)；3、細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)：miR-664 mimic組骨肉瘤細(xì)胞增殖能力明顯高于對(duì)照組(P0.05)；3、軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)：miR-664 mimic組骨肉瘤細(xì)胞非錨定生長的惡性化能力明顯高于對(duì)照組(P0.05)；4、BrdU滲入法實(shí)驗(yàn)：miR-664 mimic組S期骨肉瘤細(xì)胞明顯高于對(duì)照組(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：過表達(dá)miR-664明顯促進(jìn)U2-OS骨肉瘤細(xì)胞增殖速度、增殖能力及惡性分裂。(二)抑制miR-664抑制U2-OS骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯肯抡{(diào)miR-664對(duì)于U2-OS骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖的影響實(shí)驗(yàn)方法：以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-664 inhibitor及NC對(duì)照的U2-OS骨肉瘤細(xì)胞為模型,通過1、實(shí)時(shí)熒光免疫PCR檢測(cè)niR-664 inhibitor瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞miR-664的表達(dá)；2、MTT比色法技術(shù)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞增殖速度；3、細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力；4、軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)(Soft agar assay)檢測(cè)癌細(xì)胞非錨定生長的惡性化能力；5、BrdU滲入法(5-溴脫氧尿嘧啶核苷法)技術(shù)檢測(cè)miR-664對(duì)細(xì)胞分裂周期的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、轉(zhuǎn)染miR-664 inhibitor后,miR-664的表達(dá)降低至0.128倍(P 0.05); 2、MTT比色法實(shí)驗(yàn)：miR-664 inhibitor組骨肉瘤細(xì)胞增殖速度明顯低于對(duì)照組(P0.05)；2、細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)：miR-664 inhibitor組骨肉瘤細(xì)胞增殖能力明顯低于對(duì)照組(P0.05)；3、軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)：miR-664 inhibitor組骨肉瘤細(xì)胞非錨定生長的惡性化能力明顯低于對(duì)照組(P0.05)；4、BrdU滲入法實(shí)驗(yàn)：miR-664 inhibitor組S期骨肉瘤細(xì)胞明顯少于對(duì)照組(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：下調(diào)miR-664表達(dá)明顯抑制U2-OS骨肉瘤細(xì)胞增殖速度、增殖能力及惡性分裂。第三部分miR-664下調(diào)FOXO4促進(jìn)U2-OS骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖(一)探討miR-664對(duì)FOXO4信號(hào)途徑的作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯看龠M(jìn)骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖內(nèi)在分子機(jī)制是否通過FOXO4信號(hào)途徑調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)方法：以轉(zhuǎn)染miR-664 mimic及miR-664 inhibitor U2-OS細(xì)胞為模型,通過免疫印跡法檢測(cè)FOXO4基因蛋白表達(dá)水平,并利用實(shí)時(shí)定量PCR及免疫印跡法檢測(cè)FOXO4靶基因P21、Rb、p-Rb、CyclinDl的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、在免疫印跡法檢測(cè)中,FOXO4在miR-664 mimic U2-OS細(xì)胞中的表達(dá)降低,而在miR-664 inhibitor U2-OS細(xì)胞中的表達(dá)增高(P0.05)。2、同樣的,FOXO4靶基因p21、p-Rb在miR-664 mimic U2-OS細(xì)胞中的表達(dá)降低,而在miR-664 inhibitor U2-OS細(xì)胞中的表達(dá)增高(P0.05)。3、而細(xì)胞周期蛋白CyclinDl基因表達(dá)與FOX04相反：在miR-664 mimic U2-OS細(xì)胞中的表達(dá)增高,而在miR-664 inhibitor U2-OS細(xì)胞中的表達(dá)降低(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：miR-664能抑制FOXO4及其靶基因p21、p-Rb的表達(dá)。(二)探討miR-664對(duì)靶基因FOXO4靶向調(diào)控關(guān)系實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定miR-664對(duì)靶基因FOXO4的靶向調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)方法：使用Targetscan軟件工具尋找miR-664潛在靶基因,利用免疫印跡分析表明,在U2-OS骨肉瘤細(xì)胞對(duì)照組、miR-664 mimic組與miR-664inhibitor中FOXO4基因表達(dá)存在顯著的差異性,mimic組蛋白表達(dá)低于對(duì)照組,而inhibitor蛋白表達(dá)高于對(duì)照組。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-664與FOXO4靶向調(diào)節(jié)關(guān)系,構(gòu)建含有FOXO4-3'UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,將直接合成miR-664的rnutation轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,在對(duì)照組、miR-664 mimic、miR-664 inhibitor、miR-664 mutation U2-OS細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染FOXO4-3'UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,48小時(shí)后裂解細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶活性,確定miR-664對(duì)FOXO4-3'UTR的調(diào)節(jié)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、用Targetscan軟件工具發(fā)現(xiàn)FOXO4是miR-664的靶基因；2、熒光素酶檢測(cè)表明,FOXO4基因在對(duì)照組、miR-664 mimic、miR-664 inhibitorU2-OS細(xì)胞中,表達(dá)存在差異性(P0.05)；而在miR-664 mutation U2-OS細(xì)胞中卻無此差異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：FOXO4基因是miR-664的目標(biāo)調(diào)控基因。(三)FOXO4基因是miR-664促進(jìn)骨肉瘤惡性增殖的關(guān)鍵基因?qū)嶒?yàn)?zāi)康模貉芯縁OXO4在骨肉瘤增殖中的關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)方法：為了進(jìn)一步分析FOXO4在骨肉瘤增殖中的作用,通過特異性siRNA1#、2#阻斷FOXO4基因的2個(gè)靶點(diǎn)抑制其內(nèi)源性表達(dá),在miR-664inhibitor U2-OS細(xì)胞中,通過MTT技術(shù)、克隆實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)、BrdU技術(shù),觀察U2-OS增殖速度、增殖能力及增殖惡性化程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、通過特異性siRNA阻斷FOXO4基因的2個(gè)靶點(diǎn)后,FOXO4在miR-664 inhibitor U2-OS細(xì)胞中的內(nèi)源性表達(dá)成功被沉默(P0.05)。2、下調(diào)內(nèi)源性FOXO4基因表達(dá),U2-OS骨肉瘤細(xì)胞增殖速度、增殖能力及惡性分裂程度較對(duì)照組細(xì)胞明顯增高(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：FOXO4基因在miR-664促進(jìn)U2-OS骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖中起著關(guān)鍵作用。(四)骨肉瘤組織中miR-664與FOXO4表達(dá)相關(guān)性分析實(shí)驗(yàn)?zāi)康模悍治雠R床骨肉瘤組織中miR-664與FOXO4表達(dá)相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)時(shí)熒光免疫PCR檢測(cè)8例骨肉瘤組織和癌旁組織中miR-664表達(dá)水平；Western-Blot檢測(cè)8例骨肉瘤組織FOXO4表達(dá)水平。將二者做相關(guān)性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：統(tǒng)計(jì)學(xué)的結(jié)果顯示miR-664的表達(dá)水平與FOXO4呈負(fù)相關(guān)的線性關(guān)系(r2=0.951,p0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-664的表達(dá)水平與臨床上骨肉瘤的增殖呈正相關(guān),而FOXO4的表達(dá)水平與其呈負(fù)相關(guān)性。通過以上三部分實(shí)驗(yàn),我們可以得出本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論,miR-664下調(diào)靶基因FOXO4促進(jìn)骨肉瘤惡性增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R738.1

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本文編號(hào)：1840184