本文選題：DNA + shuffling　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學》2016年碩士論文

【摘要】：表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)及表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)在許多上皮來源的腫瘤中過表達,提供腫瘤細胞生長、轉移所必須的信號。以EGF及EGFR為靶標的抗腫瘤疫苗已成為當前腫瘤免疫治療的主要研究方向。如何增強EGF蛋白的免疫原性,打破機體對EGF蛋白的免疫耐受,是研發(fā)EGF疫苗的關鍵所在。本研究中,我們通過DNA shuffling技術,重組人、小鼠和雞的EGF外顯子片段,得到融合多物種的EGF重組蛋白。免疫小鼠后,誘導小鼠產(chǎn)生抗EGF抗體,阻斷EGF/EGFR細胞信號通路,抑制腫瘤生長。并探究了重組EGF疫苗與重組血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)疫苗聯(lián)合免疫的抗腫瘤效果。主要方法與結果如下:(1)通過PCR擴增人、小鼠和雞的EGF外顯子片段,然后用DNaseⅠ酶將擴增得到的基因切成50bp左右的小片段。將得到的小片段混合,并互為模板和引物進行PCR擴增即進行DNA shuffling重組,然后用帶酶切位點的人、小鼠和雞的EGF基因引物擴增DNA shuffling產(chǎn)物。將擴增得到的產(chǎn)物分段回收并進行雙酶切,插入到載體pET-32a,然后轉化到大腸桿菌BL21中,得到含400個轉化子的重組EGF文庫。通過菌落PCR和SDS-PAGE篩選得到22個表達重組蛋白的轉化子,將篩選得到的轉化子誘導表達蛋白并免疫小鼠,進一步篩選得到6個能誘導小鼠產(chǎn)生對小鼠EGF蛋白(mEGF)和人EGF蛋白(hEGF)均能產(chǎn)生較高抗體效價的轉化子。(2)純化篩選得到的6個轉化子重組蛋白,與MF59佐劑混合后免疫小鼠進行抗腫瘤(小鼠乳腺癌)免疫的研究。結果發(fā)現(xiàn)300號和380號兩種重組蛋白有免疫抗瘤活性,荷瘤后15天剝瘤稱重,PBS組及PBS混合MF59佐劑組的平均瘤重分別為0.372 g和0.258 g,而300號與380號重組蛋白免疫組的平均瘤重僅為0.072 g和0.038g,顯著(P0.01)低于PBS對照組。進一步研究發(fā)現(xiàn)300號和380號重組蛋白誘導小鼠產(chǎn)生的抗mEGF抗體效價分別可達3200倍和6400倍。綜合考慮,380號重組蛋白可誘導更強的免疫應答,產(chǎn)生更高效價的抗EGF抗體,具有更好的免疫抗瘤效果,可顯著抑制腫瘤的生長和延長荷瘤小鼠的生存期。經(jīng)Western Blotting驗證,380號重組蛋白免疫誘導的抗體與人EGF、小鼠EGF和380重組蛋白均能特異性結合。(3)篩選得到的380號重組EGF蛋白疫苗與重組VEGF蛋白疫苗聯(lián)合免疫,可誘導小鼠同時產(chǎn)生抗EGF抗體和抗VEGF抗體,抗體效價分別達到12800倍和6400倍。聯(lián)合免疫優(yōu)于單一EGF疫苗或VEGF疫苗的免疫治療效果,與單一免疫治療相比,聯(lián)合免疫能更好地抑制小鼠腫瘤(4T1乳腺癌)的生長和延長荷瘤小鼠的生存時間。綜上所述,DNA shuffling技術可有效重組腫瘤抗原,增強腫瘤抗原的免疫原性,打破機體對自身蛋白的免疫耐受。380號重組EGF蛋白能誘導小鼠產(chǎn)生對小鼠EGF和人EGF都具有特異性的高效價抗體,阻斷EGF/EGFR細胞信號通路,抑制4T1乳腺癌細胞生長。通過與重組VEGF蛋白疫苗的聯(lián)合免疫,探究了腫瘤疫苗聯(lián)合免疫的可行性,為腫瘤免疫治療提供了新的方向和思路。
[Abstract]:The results were as follows : ( 1 ) The results were as follows : ( 1 ) The results were as follows : ( 1 ) Using EGF and EGFR as target , we obtained the recombinant EGF library . The results were as follows : ( 1 ) The recombinant EGF gene was amplified by PCR , and then transformed into E . coli BL21 . The results showed that the anti - EGF antibody and anti - VEGF antibody could induce the growth of tumor antigen and to prolong the survival time of tumor - bearing mice .

【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.51

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