發(fā)布時(shí)間：2018-05-03 06:10

  本文選題：微小RNA + 信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3　； 參考：《青島大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:探討miR-21和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3)基因在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的表達(dá),闡明miR-21對STAT3基因的調(diào)控作用。方法:培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞,接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi),孵箱中(37℃、5%CO2)培養(yǎng),每3d換一次液,細(xì)胞貼壁達(dá)到80%左右,用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化并傳代。采用免疫熒光檢測STAT3在癌細(xì)胞中的表達(dá),取適量細(xì)胞涂片,10%甲醛固定后,每張切片滴加20μl 0.1%BSA封閉液封閉1h,以除去非特異性反應(yīng)。甩去多余液體后,滴加兔抗人STAT3抗體,4℃孵育過夜后,PBS沖洗3次,每次5min,二抗加TRITC標(biāo)記山羊抗兔Ig G抗體(1:200),37℃孵育30min,PBS沖洗3次,每次5min,DAPI復(fù)染細(xì)胞核,熒光鏡下觀察。運(yùn)用miRNA生物信息學(xué)軟件miRanda和Target Scan對miR-21和STAT3基因的靶向配對關(guān)系進(jìn)行預(yù)測;脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染miR-21 mimics進(jìn)入MCF-7細(xì)胞為mimics組,取mimics組以及空白對照組(control)細(xì)胞,分別加入Trizol或RNAiso for small RNA提取總RNA,制備1%瓊脂糖凝膠,變性電泳檢測RNA質(zhì)量,紫外分光光度計(jì)檢測總RNA或總miRNA純度和濃度。應(yīng)用RNase-free水稀釋為1μg/μl,取3μl加入反轉(zhuǎn)錄試劑盒體系中反轉(zhuǎn)錄為c DNA,稀釋后加入SYBR○R Premix Ex Taq?II和引物,跑40個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng),相對表達(dá)量用2-△△Ct計(jì)算,并對反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析。取兩組細(xì)胞分別加3ml 4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞三次,加入RIPA裂解液充分震蕩后,超聲破碎,采用BCA法測定樣品總蛋白量并計(jì)算蛋白濃度。根據(jù)濃度大小取15μl樣品SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)膜,應(yīng)用4%BSA封閉1 h,加入兔抗人STAT3抗體(1:200),4℃過夜后,TBST洗3次,每次5min,然后滴加二抗(1:800),4℃搖床1 h后,TBST洗3次,每次5min,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)和ECL試劑盒發(fā)光顯影,以β-actin作為內(nèi)參,檢測STAT3蛋白在兩組癌細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果:光鏡下見人乳腺癌MCF-7細(xì)胞成片生長,有突起;細(xì)胞免疫熒光化學(xué)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)有STAT3蛋白的表達(dá),顯示紅色熒光。生物信息學(xué)軟件Target Scan顯示miR-21在STAT3 m RNA 3’UTR上有一個(gè)保守的靶位點(diǎn),其類型為7mer-m8,匹配得分為95。miRanda結(jié)果表明miR-21與靶位點(diǎn)的mir SVR得分為-0.7660,綜合兩個(gè)生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果可以看出miR-21與STAT3基因配對良好。RNA電泳顯示所提總RNA完整性良好,沒有發(fā)生嚴(yán)重降解,能夠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過q RT-PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線發(fā)現(xiàn)目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增情況均良好,且引物特異性較好,沒有非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。q RT-PCR檢測結(jié)果顯示mimics組miR-21的表達(dá)量是control組的21.08±7.48倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);mimics組STAT3m RNA的表達(dá)量是control組的49.97±8.62%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示mimics組STAT3蛋白相對表達(dá)量(0.46±0.11)較control組(0.83±0.17)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。過表達(dá)miR-21能夠降低STAT3 m RNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)論miR-21能夠負(fù)性調(diào)控人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中STAT3基因的表達(dá)。
[Abstract]:Aim: to investigate the expression of miR-21 and signal transduction and transcriptional activator 3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3) gene in human breast cancer MCF-7 cells and to elucidate the role of miR-21 in the regulation of STAT3 gene. Methods: human breast cancer MCF-7 cells were cultured in 25cm2 culture flask and incubated in incubator at 37 鈩，

本文編號：1837310