本文選題：雞 + 等級前卵泡　； 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：產(chǎn)蛋性狀是雞的重要經(jīng)濟性狀之一,其產(chǎn)蛋性能的優(yōu)劣主要取決于雞卵巢組織等級卵泡的募集數(shù)量、優(yōu)勢選擇、等級化建立和卵泡成熟等,影響卵泡生長發(fā)育的因素有很多,其中除了受到下丘腦-垂體-性腺軸(HPG axis)所分泌的FSH、LH等激素的調(diào)節(jié)外,還受到轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族(TGF-β)和表皮生長因子家族(EGF)等的調(diào)節(jié),此外還受到某些信號通路及其成員分子的影響。本實驗室的前期研究已證明,MST1、MST2、SAV1、LATS1、MOB2和YAP1是構(gòu)成雞Hippo/MST信號通路的核心成員,同時也證明雞Hippo/MST信號通路能夠抑制其等級前卵泡的生長發(fā)育。揭示Hippo/MST信號通路各主要成員在雞優(yōu)勢卵泡選擇和等級化建立過程的作用,為深入研究卵泡發(fā)育規(guī)律,解析促進等級前優(yōu)勢卵泡選擇與等級化建立的調(diào)控原理提供理論依據(jù);也為深入發(fā)掘控制雞產(chǎn)蛋性狀的關(guān)鍵基因,開展以提高產(chǎn)蛋性狀和飼料轉(zhuǎn)化率為育種目標的地方雞種資源遺傳改良和雜種優(yōu)勢利用奠定分子基礎(chǔ),具有十分重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。然而,作為LATS1同源蛋白的LATS2在雞卵巢等級前卵泡生長發(fā)育的調(diào)控作用及其分子調(diào)控的研究目前尚未見到相關(guān)報道。本研究以150日齡海蘭褐蛋雞為實驗材料,利用相對定量RT-PCR、熒光定量RT-PCR、基因過表達、siRNA干擾、Western blotting和EDU檢測等方法分別從mRNA轉(zhuǎn)錄水平和細胞水平深入探究LATS2基因表達變化對Hippo/MST信號通路其上游基因(MST1、MST2和SAV1)、其下游基因(YAP1、TEAD1和TEAD3)以及效應(yīng)器YAP1分子的潛在靶基因——等級前卵泡顆粒細胞增殖生物標記侯選基因(FSHR、STAR、CYP11A1、ESR1和ESR2)的mRNA表達的影響,進而解析LATS2基因與它們之間的相互促抑調(diào)控關(guān)系及其對等級前卵泡顆粒細胞增殖的生物學(xué)功能,從而揭示雞LATS2基因調(diào)控卵巢等級前卵泡生長發(fā)育的作用及其功能研究。主要實驗與結(jié)果如下:1.LATS2及Hippo/MST信號通路上下游基因mRNA在卵泡中的表達特性本實驗利用相對定量RT-PCR方法檢測150日齡海蘭褐蛋雞卵巢間質(zhì)和不同直徑卵泡中MST1、MST2、LATS2、YAP1、TEAD1和TEAD3基因mRNA的表達水平,然后進行灰度值分析。結(jié)果顯示,MST1、MST2、LATS2、YAP1、TEAD1和TEAD3基因mRNA在卵巢間質(zhì)和不同直徑卵泡中均有表達,并且其在等級前卵泡的整體mRNA相對表達量顯著高于等級卵泡的整體mRNA相對表達量(P㩳0.05)。由此說明MST1、MST2、LATS2、YAP1、TEAD1和TEAD3基因與雞卵泡的生長發(fā)育密切相關(guān),但具體的調(diào)控機制還需要以下實驗進行檢驗。2.過表達LAST2基因?qū)ippo/MST信號通路其上游基因(MST1、MST2和SAV1)、其下游基因(YAP1、TEAD1和TEAD3)以及等級前卵泡顆粒細胞增殖生物標記侯選基因(FSHR、STAR、CYP11A1、ESR1和ESR2)的mRNA表達的影響和對等級前卵泡顆粒細胞增殖的調(diào)控作用本實驗通過載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染、相對定量RT-PCR、熒光定量RT-PCR、Western blotting等方法以及EDU試劑盒進行檢測。結(jié)果顯示,過表達LATS2基因后MST1、MST2、TEAD1和TEAD3基因的mRNA表達水平顯著上調(diào)(P㩳0.05),SAV1和YAP1基因的mRNA表達水平顯著下調(diào)(P㩳0.05);而生物標記候選基因(FSHR、STAR、CYP11A1、ESR1和ESR2)mRNA表達水平顯著下調(diào)(P㩳0.05),同時EDU檢測雞等級前卵泡顆粒細胞的增殖顯著減少(P㩳0.05)。說明過表達LATS2基因?qū)ST1、MST2、TEAD1和TEAD3具有促進作用,對SAV1和YAP1具有抑制作用,同時抑制雞等級前卵泡顆粒細胞的增殖,進而說明LATS2基因?qū)﹄u等級前卵泡的生長發(fā)育具有調(diào)控作用,為了驗證此結(jié)果的可信度,我們還需要進行下一步驗證。3.siRNA干擾LAST2基因?qū)ippo/MST信號通路其上游基因(MST1、MST2和SAV1)、其下游基因(YAP1、TEAD1和TEAD3)以及等級前卵泡顆粒細胞增殖生物標記侯選基因(FSHR、STAR、CYP11A1、ESR1和ESR2)的mRNA表達的影響和對等級前卵泡顆粒細胞增殖的調(diào)控作用本實驗通過將干擾片段siRNA-LATS2轉(zhuǎn)染至雞等級前顆粒細胞(4-8 mm)中,再利用相對定量RT-PCR、熒光定量RT-PCR、Western blotting以及EDU試劑盒進行檢測。結(jié)果顯示siRNA干擾LATS2基因后MST1、MST2、TEAD1和TEAD3基因的mRNA表達水平顯著下調(diào)(P㩳0.05),SAV1和YAP1基因的mRNA表達水平顯著上調(diào)(P㩳0.05),而生物標記候選基因(FSHR、STAR、CYP11A1、ESR1和ESR2)mRNA表達水平均顯著上調(diào)(P㩳0.05),同時雞等級前卵泡顆粒細胞的增殖顯著(P㩳0.05),這與LATS2過表達實驗結(jié)果恰好相反。siRNA干擾LATS2基因?qū)ST1、MST2、TEAD1和TEAD3具有抑制作用,對SAV1和YAP1具有促進作用,同時促進雞等級前卵泡顆粒細胞的增殖。綜合實驗2和實驗3的結(jié)果表明LATS2基因?qū)ST1、MST2、TEAD1和TEAD3具有促進作用,對SAV1和YAP1具有抑制作用,同時對雞等級前卵泡的生長發(fā)育具有抑制作用。4.ESR1和ESR2基因SNPs的檢測及其與產(chǎn)蛋性狀間的關(guān)聯(lián)分析因為ESR1和ESR2在實驗2和3中mRNA表達變化能夠影響雞等級前卵泡顆粒細胞的增殖與分化,同時大骨雞是優(yōu)良的蛋肉兼用型地方雞種,本實驗為深入發(fā)掘控制雞產(chǎn)蛋性狀的關(guān)鍵基因,并以提高產(chǎn)蛋性狀和飼料轉(zhuǎn)化率為育種目標的地方雞種資源遺傳改良和雜種優(yōu)勢利用奠定基礎(chǔ),故利用PCR-SSCP和DNA測序分析技術(shù)篩選ESR1和ESR2基因與大骨雞產(chǎn)蛋性狀相關(guān)聯(lián)的SNP位點。結(jié)果顯示,在ESR1基因外顯子4上發(fā)生T1101C的轉(zhuǎn)換,ESR2基因外顯子8上發(fā)生G1755A的轉(zhuǎn)換,其中ESR1和ESR2基因的TT和GG純合基因型個體在30、43、57、66周齡的產(chǎn)蛋量顯著高于CT和GA雜合基因型個體的產(chǎn)蛋量(P㩳0.05),而CT和GA雜合基因型個體在30周齡的蛋重顯著高于TT和GG純合基因型個體的蛋重(P㩳0.05)。根據(jù)兩個SNPs組合可以得到4種組合基因型,其中TTGG組合基因型個體在30、43、57、66周齡的產(chǎn)蛋量顯著高于TTGA、CTGG和CTGA組合基因型個體的產(chǎn)蛋量,CTGA組合基因型個體在30和43周齡的體重顯著高于TTGG組合基因型個體的體重,CTGA組合基因型個體在30和43周齡的蛋重顯著高于TTGG和TTGA組合基因型個體的蛋重。并且這兩個SNPs在大骨雞產(chǎn)蛋性狀中的遺傳方差百分比相對較高(P㧐1%)。本研究明確了MST1、MST2、LATS2、YAP1、TEAD1和TEAD3基因mRNA在卵巢間質(zhì)和不同直徑卵泡中均有表達,并且各個基因mRNA的最高表達量均出現(xiàn)在等級前卵泡中,與等級卵泡的mRNA表達水平有顯著差異(P㩳0.05);揭示了LATS2基因?qū)ST1、MST2、TEAD1和TEAD3具有促進作用,對SAV1和YAP1具有抑制作用;證明了LATS2基因能夠抑制海蘭褐蛋雞等級前卵泡的生長發(fā)育;同時明確了ESR1和ESR2的SNP位點T1101C和G1755A與大骨雞的產(chǎn)蛋性狀具有顯著關(guān)聯(lián)性(P㩳0.05)。本研究揭示了LATS2基因調(diào)控雞等級前卵泡生長發(fā)育的作用,進一步完善了雞卵泡發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò);同時為更深入地研究雞Hippo/MST信號通路調(diào)控等級前卵泡的作用機制奠定基礎(chǔ),為雞卵泡優(yōu)勢選擇和等級化建立的遺傳機理提供理論依據(jù);也為開展以提高產(chǎn)蛋性狀和飼料轉(zhuǎn)化率為育種目的的地方雞種資源遺傳改良和雜種優(yōu)勢利用奠定分子基礎(chǔ),具有十分重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。
[Abstract]:The effects of LATS2 gene expression on the growth and development of the chicken ' s Hippo / MST signal pathway were studied . The mRNA expression levels of MST1 , MST2 , LATS2 , YAP1 , TEAD1 and TEAD3 were significantly decreased ( P ? 0.05 ) . The results of experiments 2 and 3 showed that the mRNA expression levels of MST1 , MST2 , TEAD1 and TEAD3 decreased significantly ( P ? 0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S831

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