本文選題：特征綜合性 + 血漿��； 參考：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分:45,XO特納綜合征患者血漿小RNA組學(xué)研究目的:篩選45,XO特納綜合征(TS)與正常46,XX女性差異表達(dá)的血漿microRNA(miRNA)材料與方法:收集10例未進(jìn)行激素替代治療的純合45,X0病人血漿及10例月經(jīng)周期正常的46,XX女性血漿。采用HiSeq 2000測序平臺,對血漿中的小RNA進(jìn)行測序。用Ingenuity Pathway Analysis軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。對其中幾種差異顯著的高表達(dá)血漿miRNA,進(jìn)行擴(kuò)大樣本量的real time quantitative PCR(qRT-PCR)驗證。結(jié)果:共篩選到182種差異表達(dá)的miRNA,其中85種在45,XO組和46,XX組存在顯著差異。生物信息學(xué)分析顯示差異表達(dá)的miRNA,與特納患者先天發(fā)育異常、生殖系統(tǒng)疾病、智力低下等異常臨床表現(xiàn)密切相關(guān)。qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步證實miR-320、miR-486-5p、let-7a-5p等miRNA在兩組間存在顯著差異。結(jié)論:小RNA組學(xué)分析顯示45,XO患者較46,XX,血漿miRNA表達(dá)譜明顯改變。這些改變的miRNA與45,XO異常臨床表型密切相關(guān),提示miRNA可能在其中有潛在作用。第二部分:特納綜合征差異表達(dá)的microRNA與X染色體逃逸失活基因關(guān)系研究目的:探索特納綜合征差異表達(dá)的microRNA與X染色體逃逸失活基因關(guān)系。材料與方法:檢測核型為45,XO、46,XX、46,XY、47,XXY患者外周血單個核細(xì)胞(PMBC)miR-320a,miR-486-5p及逃逸失活基因 KDM5C,KDM6A,DDX3X的表達(dá)水平,探索其潛在的關(guān)聯(lián)性。同時在核型為45,XO、46,XX流產(chǎn)胚胎性腺組織中驗證。通過體外細(xì)胞實驗,驗證前面發(fā)現(xiàn)的microRNA與X染色體逃逸失活基因關(guān)系。結(jié)果:與血漿結(jié)果一致,miR-320a,miR-486-5p在45,XO的PMBC和流產(chǎn)胚胎性腺組織中高表達(dá)。通過45,XO、46,XX、46,XY、47,XXY四組比較,發(fā)現(xiàn)miR-320a,miR-486-5p與性染色體數(shù)目成負(fù)相關(guān)。同時在四組中驗證了具有X/Y同源基因的KDM5C為逃逸失活基因,其在45,XO的PMBC和流產(chǎn)胚胎性腺組織中低表達(dá),與miR-320a,miR-486-5p表達(dá)存在負(fù)相關(guān)。體外細(xì)胞實驗,發(fā)現(xiàn)干擾KDM5C 后,miR-320a,miR-486-5p,miR-320a 的初始產(chǎn)物 pri-miR-320a 高表達(dá),而miR-486-5p的初始產(chǎn)物pri-miR-486-5p沒有改變,提示KDM5C能夠負(fù)向調(diào)控miR-320a起始轉(zhuǎn)錄。而miR-320a過表達(dá)后KDM5C沒有改變,提示miR-320a不能調(diào)控KDM5C表達(dá)。熒光素酶報告基因及ChIP實驗,證實敲低作為轉(zhuǎn)錄抑制因子的H3K4me3去甲化酶KDM5C,可以解除其對編碼miR-320a基因的啟動子特定區(qū)段抑制作用,使該區(qū)域轉(zhuǎn)錄激活標(biāo)志H3K4me3水平升高,miR-320a表達(dá)增加。結(jié)論:PMBC和流產(chǎn)胚胎性腺組織中,45,XO的miR-320a,miR-486-5p高表達(dá),且與X染色體逃逸失活基因KDM5C水平呈負(fù)相關(guān)。敲低KDM5C后,能夠通過增加miR-320a啟動子特定區(qū)域H3K4me3的水平,反式激活miR-320a的轉(zhuǎn)錄。第三部分:X染色體基因調(diào)控的microRNA在特納綜合征先天性腺發(fā)育不全中作用研究目的:探索miR-320a及KDM5C在特納綜合征先天性腺發(fā)育不全中的作用。材料與方法:在原代培養(yǎng)的胎兒卵巢細(xì)胞(HFO)中,分別轉(zhuǎn)染miR-320a的模擬物及KDM5C小干擾RNA,檢測與卵巢發(fā)育相關(guān)因子的改變。同時通過熒光素酶報告基因驗證軟件預(yù)測的miR-320a靶點。結(jié)果:HFO細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)入miR-320a的模擬物及KDM5C小干擾RNA后,KITLG和BMP5的表達(dá)水平明顯下降。轉(zhuǎn)染miR-320a的抑制物后,KDM5C小干擾RNA對KITLG的抑制作用明顯減弱。軟件和熒光素酶報告基因證實KITLG是miR-320a的直接作用靶點。westerone blot實驗發(fā)現(xiàn)45,XO的流產(chǎn)胎兒性腺組織的KITLG水平明顯低于46,XX。結(jié)論:卵巢發(fā)育重要因子KITLG是miR-320a的直接作用靶點,上調(diào)的miR-320a及干擾KDM5C均可使其表達(dá)下調(diào)。其可能在特納先天性性腺發(fā)育不全中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:The first part: 45, the purpose of the small RNA group study of XO Turner syndrome patients: to screen the plasma microRNA (miRNA) materials and methods of 45, XO Turner syndrome (TS) and normal 46, XX women: collect 10 cases of homozygous 45 without hormone replacement therapy, X0 patient's blood plasma and 10 cases of normal menstrual cycle 46, XX female plasma. HiSeq 2000 Sequencing and sequencing of small RNA in plasma. Bioinformatics analysis was performed with Ingenuity Pathway Analysis software. A few significant high expression of plasma miRNA and real time quantitative PCR (qRT-PCR) were tested. Results: 182 kinds of differential expression miRNA were screened, of which 85 were 45, XO and 4 6, there were significant differences in the XX group. Bioinformatics analysis showed that differential expression of miRNA was closely related to abnormal clinical manifestations of congenital dysplasia, reproductive system disease and mental retardation in Turner patients..qRT-PCR results further confirmed that miR-320, miR-486-5p, let-7a-5p and miRNA were significantly different among the two groups. Conclusion: small RNA analysis showed that there was a significant difference between groups. 45, XO patients are more than 46, XX, and plasma miRNA expression profiles. These changes of miRNA are closely related to abnormal clinical phenotypes of 45 and XO, suggesting that miRNA may have potential roles. The second part: Study on the relationship between microRNA and X chromosomal escape inactivation genes differentially expressed by Turner syndrome: to explore the differentially expressed microRNA syndrome of Turner syndrome X chromosome escape inactivation genes. Materials and methods: to detect the expression level of KDM5C, miR-486-5p and escape inactivation genes KDM5C, KDM6A, DDX3X in peripheral blood mononuclear cells (PMBC) of patients with 45, XO, 46, XX, 46, XY, 47, XXY, and explore the potential correlation in the karyotype 45, XO, 46, abortion embryo gonadal tissue. In vitro cell test, the relationship between microRNA and X chromosome escape inactivation genes was verified. Results: in accordance with the plasma results, miR-320a, miR-486-5p were highly expressed in 45, XO PMBC and abortion embryo gonadal tissues. Through 45, XO, 46, XX, XY, 47, XXY four found miR-320a, miR-486-5p and sex chromosomes were negatively correlated. In four groups, the X/Y homologous KDM5C was proved to be an escape inactivation gene, which was low expression in 45, XO PMBC and aborted embryo gonadal tissue, and negative correlation with miR-320a, miR-486-5p expression. In vitro cell experiment, after the disturbance of KDM5C, the initial high expression of miR-320a, miR-486-5p, miR-320a was found, and miR-486-5p The initial product pri-miR-486-5p does not change, suggesting that KDM5C can negatively regulate the transcription of miR-320a. While miR-320a overexpression, KDM5C does not change, suggesting that miR-320a does not regulate KDM5C expression. The luciferase reporter gene and ChIP experiments have proved that the H3K4me3 normethylation KDM5C, which is a transcriptional inhibitor, can be relieved of its mi coding. The inhibition action of the specific promoter of the R-320a gene makes the transcriptional activation marker H3K4me3 level and miR-320a expression increase in the region. Conclusion: in PMBC and abortion embryo gonadal tissues, 45, XO miR-320a, miR-486-5p are highly expressed and negatively correlated with KDM5C water level of the X chromosome escape inactivation gene. After knocking down KDM5C, the miR-320a can be increased by miR-320a. The level of H3K4me3 in the specific promoter region and trans activation of the transcription of miR-320a. Third part: the role of microRNA regulated by X chromosome in innate gonadoplasia of Turner syndrome: To explore the role of miR-320a and KDM5C in the congenital gonadal dysplasia of Turner syndrome. Materials and methods: in the primary culture of fetal eggs In nesting cells (HFO), miR-320a mimics and KDM5C small interference RNA were respectively transfected to detect changes in ovarian development related factors. At the same time, the miR-320a target of the software predicted by the luciferase reporter gene was verified. Results: HFO cells were transferred to miR-320a mimics and KDM5C small interference RNA, KITLG and BMP5 decreased significantly. After transfection of miR-320a inhibitor, the inhibitory effect of KDM5C small interference RNA on KITLG was obviously weakened. The software and luciferase reporter gene confirmed that KITLG was the direct target of miR-320a, the.Westerone blot experiment found 45, the KITLG level of the aborted fetal gonadal tissues of XO was obviously lower than 46, and the XX. conclusion: the important factor of ovarian development is KITLG. The direct target, the up regulation of miR-320a and the interference of KDM5C can reduce their expression, which may play an important role in Turner's congenital gonadal hypoplasia.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R711.1

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本文編號：1826170