發(fā)布時(shí)間：2018-04-26 21:04

  本文選題：c-di-GMP + 嗜酸乳桿菌��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景和目的c-di-GMP(環(huán)二鳥(niǎo)苷酸)是一種由兩分子GTP縮合形成的環(huán)二核苷酸,為細(xì)菌中廣泛存在的第二信使,參與調(diào)控多項(xiàng)細(xì)菌生理功能。含GGDEF結(jié)構(gòu)域的二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(diguanylate cyclase,DGC)和含EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)調(diào)控著菌內(nèi)c-di-GMP的平衡。嗜酸乳桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌,能發(fā)酵多種糖,產(chǎn)酸能力強(qiáng),可使菌斑pH下降,同時(shí)具有很高的耐酸力,是公認(rèn)的齲病相關(guān)主要細(xì)菌之一。我們前期通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):在嗜酸乳桿菌的基因組中存在一個(gè)c-di-GMP合成酶(DgcA)的編碼基因(NH13_07045)和兩個(gè)分解酶(PdeA和PdeB)的編碼基因(NH13_07050和NH13_07055)。本研究首次在嗜酸乳桿菌ATCC4356中研究c-di-GMP信號(hào)通路,探索c-di-GMP調(diào)控嗜酸乳桿菌生理活動(dòng)的信號(hào)機(jī)制,為齲病的防治提供新的依據(jù)。方法首先采用生物信息學(xué)方法分析嗜酸乳桿菌中三個(gè)涉及c-di-GMP上游代謝通路的基因以及編碼蛋白。使用質(zhì)粒pMAL-c2-His對(duì)NH13_07045-GGDEF結(jié)構(gòu)域編碼基因片段,NH13_07050和NH13_07055基因全長(zhǎng)進(jìn)行克隆、表達(dá)及純化,獲得目的融合蛋白后,分別進(jìn)行體外酶活性實(shí)驗(yàn),使用高效液相色譜分析反應(yīng)產(chǎn)物。使用阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒pBAD-Myc-His對(duì)NH13_07045基因全長(zhǎng)進(jìn)行克隆,在大腸桿菌MG1655和BL21中表達(dá),分別進(jìn)行動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)和剛果紅結(jié)合實(shí)驗(yàn)觀察大腸桿菌的表型變化來(lái)鑒定DgcA是否具有DGC活性。對(duì)PdeB-EAL結(jié)構(gòu)域進(jìn)行表達(dá)純化,獲得目的融合蛋白后,與Fluo-c-di-GMP和Biotin-c-di-GMP 分別進(jìn)行 DRaCALA(Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay)和紫外交聯(lián)實(shí)驗(yàn)。使用Biotin-c-di-GMP偶聯(lián)磁珠在嗜酸乳桿菌總蛋白中進(jìn)行親和拉下實(shí)驗(yàn),聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,銀染觀察,并切取條帶進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多肽測(cè)序。提取嗜酸乳桿菌ATCC4356的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),對(duì)NH13_07045-NH13_07065的基因進(jìn)行操縱子序列分析�？寺H13_07060基因,在大腸桿菌中過(guò)表達(dá),進(jìn)行剛果紅結(jié)合實(shí)驗(yàn)和生物膜形成實(shí)驗(yàn)分析其編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶功能。結(jié)果對(duì)c-di-GMP代謝相關(guān)基因以及編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為進(jìn)一步基因克隆、表達(dá)純化,酶活性分析提供理論依據(jù)。成功構(gòu)建表達(dá)載體pMAL-7045-GGDEF(GGDEFDgcA)、pMAL-7050(PdeA)和 pMAL-7055(PdeB),通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá),并純化后,獲得目的融合蛋白。體外酶活性實(shí)驗(yàn)證明含EAL結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)蛋白PdeA具有PDE活性,能特異性水解c-di-GMP。成功構(gòu)建pBAD-7045(DgcA)表達(dá)載體,在誘導(dǎo)條件下,大腸桿菌MG1655和BL21呈現(xiàn)胞內(nèi)高濃度c-di-GMP的表型,證明DgcA蛋白具有DGC活性,能合成c-di-GMP。成功構(gòu)建表達(dá)載體pMAL-7055-EAL(EALpdeB),通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)并純化后,獲得目的融合蛋白,DRaCALA和紫外交聯(lián)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PdeB的EAL結(jié)構(gòu)域與c-di-GMP能特異性結(jié)合。通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜的多肽測(cè)序,在嗜酸乳桿菌總蛋白中篩選出27個(gè)可能與c-di-GMP直接或間接結(jié)合的蛋白。對(duì)cDNA的PCR分析結(jié)果顯示,NH13_07045(編碼c-di-GMP合成酶DgcA)和NH13_07050(編碼 c-di-GMP 降解酶 PdeA)屬于同一操縱子,NH13_07055(編碼c-di-GMP特異性受體CrpA(PdeB))、編碼基因NH13_07060(編碼糖基轉(zhuǎn)移酶)和NH13_07065(編碼假定蛋白)屬于同一操縱子。成功構(gòu)建pBAD-7060質(zhì)粒,在大腸桿菌BL21和MG1655中過(guò)表達(dá),其表多糖和生物膜形成量增多。結(jié)論首次在嗜酸乳桿菌中證明存在c-di-GMP信號(hào)通路,DgcA與PdeA具有合成和降解c-di-GMP的酶活性。含退化EAL結(jié)構(gòu)域的CrpA(PdeB)為c-di-GMP下游受體蛋白,同時(shí)篩選出嗜酸乳桿菌中27個(gè)c-di-GMP的潛在受體蛋白。證明了 DgcA和PdeA由同一操縱子所編碼,調(diào)控菌體內(nèi)c-di-GMP的濃度,而c-di-GMP受體CrpA與未知功能的糖基轉(zhuǎn)移酶和假定跨膜蛋白由另一個(gè)操縱子編碼。證實(shí)了 NH13_07060編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶與細(xì)菌表多糖和生物膜的形成有關(guān)。這提示c-di-GMP在嗜酸乳桿菌中可能參與調(diào)控表多糖和生物膜形成,從而影響嗜酸乳桿菌的致齲特性。以上結(jié)果為進(jìn)一步明確c-di-GMP在嗜酸乳桿菌中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:In this study , we studied the expression and purification of c - di - GMP in Escherichia coli MG1655 and BL21 . The expression vector pMAL - 7055 - EAL ( EALpdeB ) was successfully constructed .

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R781.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1807657