本文選題：原發(fā)性先天性視網(wǎng)膜色素變性 + 原發(fā)性先天性青光眼��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：遺傳疾病是指遺傳物質(zhì)改變而導(dǎo)致的疾病,且能由親代傳遞于后代。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種眼睛疾病與遺傳相關(guān)如原發(fā)性先天性青光眼(Primary congential glaucoma,PCG;OMIM231300)、視網(wǎng)膜母細胞瘤、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP;OMIM226800)、先天性紅綠色盲、高度近視等。其中,PCG和RP是兩種非常嚴重的遺傳致盲性疾病。目前,雖然有不少RP和PCG的致病基因及突變位點得到了鑒定,但這些基因及突變并不能完全解釋所有患者的患病,提示仍然有新的致病基因或突變位點存在。定位克隆、功能克隆等方式是發(fā)現(xiàn)這些疾病致病基因的重要手段。但其具有一定局限性,例如某些疾病家系信息難以收集,疾病的生理生化機制不明等。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展,全外顯子組測序(Whole-exomesequencing,WES)技術(shù)在遺傳疾病研究中的應(yīng)用越來越廣泛。該技術(shù)利用序列捕獲方法將全基因組范圍外顯子區(qū)域的DNA捕獲并富集后進行高通量測序。另外,該技術(shù)還具備靈敏度高,花費低,能夠同時發(fā)現(xiàn)已知致病基因和未知致病基因突變等優(yōu)勢。本課題組采用WES技術(shù)對RP和PCG患者進行測序,以期發(fā)現(xiàn)新的致病基因或新的突變位點,并進一步利用細胞生物學(xué)和動物模型等初步功能研究來驗證新的致病基因的可靠性。結(jié)果顯示,1)在印度RP人群中,我們發(fā)現(xiàn)了已知致病基因EYS的新突變。這些突變包括三對復(fù)合性雜合突變c.[8422GA];[7868GA]、c.[4606cg];[5038ag]和c.[1418gt];[2971ct],7個純合突變c.[1872ga]、c.[8455dela]、c.[9059tc]、c.[8388ca]、c.[7187gc]、c.[2259+1ga]和c.[3024ca]。2)對于課題組前期鑒定的pcg新候選基因p-x,我們進行了初步的功能學(xué)研究。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示,該基因突變位點c.c58t(p.r20x)和c.a232g(p.i78v)的氨基酸殘基位于蛋白β折疊區(qū);并且前者可導(dǎo)致截斷蛋白的產(chǎn)生,后者突變氨基酸殘基位于β-折疊與α-螺旋連接處,而該區(qū)域位于p-x蛋白gtp酶活性區(qū);在mrna水平,該基因在人和小鼠視網(wǎng)膜均有表達,此外在小鼠的視網(wǎng)膜色素上皮、虹膜、睫狀體、視杯、晶狀體和角膜都也有表達。在蛋白水平上,通過組織免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),該基因在人視網(wǎng)膜感光細胞及神經(jīng)節(jié)細胞有較強表達;在小鼠視網(wǎng)膜、房角,虹膜等部位有較強表達。生物細胞學(xué)實驗結(jié)果顯示,該蛋白主要表達于細胞漿;并且通過構(gòu)建突變型質(zhì)粒,我們成功地驗證了突變位點對蛋白表達的影響。其中,突變位點c.[58ct]使得蛋白表達缺失,而c.[232ag]突變則出現(xiàn)蛋白在細胞內(nèi)的分布出現(xiàn)異常。這些結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果一致。3)對于基因p-x體內(nèi)功能的研究,我們在斑馬魚中,通過顯微注射morpholino(mo)阻抑p-x蛋白表達,發(fā)現(xiàn)斑馬魚眼睛的發(fā)育受到了影響,表現(xiàn)為眼睛變小,神經(jīng)節(jié)細胞、視桿細胞、視錐細胞變少,分布異常。為了檢測其原因,我們通過tunel方法標(biāo)記凋亡細胞,磷酸化組蛋白抗體標(biāo)記增殖細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻抑p-x蛋白表達的斑馬魚視網(wǎng)膜細胞增殖異常,而凋亡與正常對照無差異,提示p-x可能通過影響視網(wǎng)膜細胞的增殖而參與了pcg的發(fā)病。然而,其具體機制有待進一步研究。綜上所述,1)我們通過全外顯子測序技術(shù),發(fā)現(xiàn)了印度rp患者已知致病基因EYS的新突變位點包括三對復(fù)合性雜合突變,7個純合突變,豐富了RP致病基因突變譜;2)對前期發(fā)現(xiàn)的PCG可能致病基因P-X及其突變c.[58CT]和c.[232AG]進行了初步的功能研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),該基因可能通過影響視網(wǎng)膜細胞增殖而影響眼睛發(fā)育,從而導(dǎo)致PCG的發(fā)生。
[Abstract]:Genetic disease is a disease caused by genetic material change and can be transferred to offspring by parent generation . It has been found that many kinds of eye diseases are related to genetic correlation such as primary congenital glaucoma ( PCGs ) . In addition , it has some limitations , such as the difficulty in collecting DNA from exon regions of the whole genome and the unknown pathogenic gene mutation . A preliminary functional study was carried out in mice retina , iris , ciliary body , visual cup , lens and cornea . In order to detect its causes , we found that the expression of p - x protein in zebrafish was affected by microinjection of Pino ( mo ) . The results showed that the expression of p - x protein in zebrafish was affected by the proliferation of retinal cells . The results showed that p - x could influence the proliferation of retinal cells . The results showed that the gene could influence the development of the eye by affecting the proliferation of retinal cells .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R596

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本文編號：1805383