本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 + 可注射水凝膠��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)移植治療心肌梗死(MyocardialInfarction,MI)極有發(fā)展前景,但臨床試驗結(jié)果顯示治療效果微弱,移植細(xì)胞在缺血心肌極低的滯留率和存活率是主要原因之一。對MSC進(jìn)行基因修飾或使用生物材料來承載后移植可改善這一問題。Bcl-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)基因能抑制細(xì)胞凋亡。VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)基因能促血管生成�？勺⑸渌z(Injectable Hydrogel,IH)具有可注射性、生物降解性和組織細(xì)胞相容性,能承載細(xì)胞進(jìn)行移植。目的:使用IH聯(lián)合Bcl-2和VEGF雙基因修飾擬提高M(jìn)SC移植對MI的療效,為臨床使用提供實驗基礎(chǔ)及理論依據(jù)。方法和結(jié)果:1、PCR擴(kuò)增獲取Bcl-2和VEGF基因并使用T2A序列連接以實現(xiàn)雙基因的共表達(dá)。構(gòu)建能同時攜帶Bcl-2和VEGF基因的慢病毒載體并篩選構(gòu)建能穩(wěn)定過表達(dá)Bcl-2和VEGF基因的SD大鼠MSC。熒光定量PCR和Western blot結(jié)果證實Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC對比Bcl-2或VEGF單基因表達(dá)MSC對Bcl-2和VEGF基因有更高的表達(dá)。CCK-8結(jié)果說明Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC對比Bcl-2或VEGF單基因表達(dá)MSC增殖更快。2、體外糖氧剝奪(Oxygen and Glucose Deprivation,OGD)模型模擬體內(nèi)缺血缺氧微環(huán)境,實驗分為五組:MSC-GFP組、MSC-VEGF組、MSC-Bcl-2組、MSC-BV 組、MSC-GFP 正常培養(yǎng)組。AnnexinV-FITC/PI 流式細(xì)胞術(shù)和 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3,結(jié)果表明OGD誘發(fā)了MSC的凋亡,Bcl-2或VEGF單基因修飾的MSC凋亡減少,Bcl-2和VEGF雙基因修飾的MSC-BV較Bcl-2或VEGF單基因修飾的MSC凋亡減少更顯著。ELISA結(jié)果顯示Bcl-2和VEGF雙基因修飾能增強OGD環(huán)境下MSC旁分泌VEGF,bFGF,HGF 和 IGF-1。3、IH攜帶Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC進(jìn)行對MI大鼠的移植治療,實驗分為六組:SHAM組、PBS組、IH組、MSC組、MSC+BV組、MSC+BV+IH組。細(xì)胞移植治療4周后心臟超聲結(jié)果提示MSC+BV+IH組的心臟收縮功能改善更顯著。HE和Masson染色結(jié)果提示MSC+BV+IH組的梗死面積顯著縮小。cTnT免疫熒光結(jié)果提示MSC+BV+IH組心肌存活更多。TUNEL和Western blot結(jié)果提示MSC+BV+IH組心肌細(xì)胞凋亡減少更顯著。vWF和a-SMA免疫熒光結(jié)果提示MSC+BV+IH組血管密度更高。CM-Dil標(biāo)記MSC移植提示MSC+BV+IH組的細(xì)胞滯留改善更明顯。4、原代培養(yǎng)SD乳鼠心肌細(xì)胞,與MSC使用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)置于1%02缺氧處理24h,實驗分為四組:心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)組、心肌細(xì)胞缺氧組、心肌細(xì)胞+MSC+GFP缺氧組、心肌細(xì)胞+MSC+BV缺氧組。采用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)、Western blot檢測凋亡蛋白Cleaved-capase-3、TUNEL分析心肌細(xì)胞凋亡,結(jié)果表明與Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC共培養(yǎng)更能減少缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞的凋亡。結(jié)論:1、成功構(gòu)建了 Bl-2和VEGF雙基因共表達(dá)重組慢病毒載體;篩選構(gòu)建了Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC;對比Bcl-2或VEGF單基因表達(dá)MSC,其對目的基因Bcl-2和VEGF有更高的表達(dá),更快的增殖速度。2、Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC對比Bcl-2或VEGF單基因表達(dá)MSC在體外糖氧剝奪環(huán)境下發(fā)揮更好的自我保護(hù)和旁分泌作用。3、Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC移植對心肌梗死有更好的治療作用,可注射水凝膠的承載移植進(jìn)一步增強了 MSC的治療作用。4、Bcl-2和VEGF雙基因共表達(dá)MSC體外通過旁分泌作用保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞。
[Abstract]:Background: Mesenchymal Stem Cell (MSC) transplantation is very promising for the treatment of myocardial infarction (MyocardialInfarction, MI), but the results of clinical trials show that the treatment effect is weak. The very low retention rate and survival rate of the transplanted cells in the ischemic myocardium is one of the main reasons. Gene modification to MSC or the use of biological materials is used. Transplantation can improve this problem.Bcl-2 (B-cell Lymphoma 2, Bcl-2) gene can inhibit apoptosis.VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) gene can promote angiogenesis. Injectable hydrogel (Injectable Hydrogel) has injectable, biodegradability and tissue cell compatibility, can carry cells for transplantation. IH combined with Bcl-2 and VEGF double gene modification to improve the effect of MSC transplantation on MI, provide experimental basis and theoretical basis for clinical use. Methods and results: 1, PCR amplification to obtain Bcl-2 and VEGF genes and the use of T2A sequence connection to realize the co expression of double genes. The results of MSC. fluorescence quantitative PCR and Western blot in SD rats that could stabilize the expression of Bcl-2 and VEGF genes confirmed that Bcl-2 and VEGF double genes co expressed MSC contrastive Bcl-2 or VEGF monogenic expression. .2, Oxygen and Glucose Deprivation (OGD) model was used to simulate the microenvironment of ischemic anoxia in vivo. The experiment was divided into five groups: MSC-GFP group, MSC-VEGF group, MSC-Bcl-2 group, MSC-BV group, MSC-GFP normal culture group,.AnnexinV-FITC/PI flow cytometry and apoptosis related protein The results showed that the apoptosis of MSC was induced by OGD, and the apoptosis of MSC modified by Bcl-2 or VEGF was reduced. The MSC-BV of Bcl-2 and VEGF modified MSC-BV was more significant than that of Bcl-2 or VEGF single gene modification. The experiment was divided into six groups: group SHAM, group PBS, group PBS, group IH, group IH, group MSC, MSC+BV group, MSC+BV+IH group. The cardiac ultrasound results suggested that the cardiac contractile function of the MSC+BV+IH group was improved more notably by the.HE and Masson staining results, suggesting that the infarct area of the MSC+BV+IH group was significantly reduced. The results of pestilence fluorescence suggested that the myocardium survived more.TUNEL and Western blot in the MSC+BV+IH group, suggesting that the cardiomyocyte apoptosis decreased more significantly in MSC+BV+IH group.VWF and a-SMA immunofluorescence results suggested that the blood vessel density of MSC+BV+IH group was higher and.CM-Dil marked MSC transplantation suggested that the cell retention of MSC+BV+IH group was more obvious. Cell, and MSC Transwell co culture system was placed in 1%02 hypoxia treatment 24h, and the experiment was divided into four groups: normal culture group of myocardial cells, hypoxia group of myocardial cells, +MSC+GFP anoxic group of myocardium, +MSC+BV anoxic group of myocardial cells, Annexin V-FITC/PI flow cytometry, Western blot detection of apoptotic protein Cleaved-capase-3, TUNEL analysis myocardium The results showed that co expression of Bcl-2 and VEGF double genes co expressed MSC co culture could reduce the apoptosis of cardiomyocytes in anoxic state. Conclusion: 1, Bl-2 and VEGF double genes were successfully constructed to co express recombinant lentivirus vector, and Bcl-2 and VEGF double genes were constructed to co express MSC, and Bcl-2 or VEGF single gene expression MSC was compared to the target gene. Bcl-2 and VEGF have higher expression, faster proliferation rate.2, Bcl-2 and VEGF double genes co express MSC to compare Bcl-2 or VEGF single gene expression MSC to play a better self protection and paracrine role in the environment of oxygen deprivation in vitro.3, Bcl-2 and VEGF double gene co expression transplantation has a better therapeutic effect on myocardial infarction, and can be injected hydrogel. The bearing transplantation further enhanced the therapeutic effect of MSC..4, Bcl-2 and VEGF coexpressed MSC in vitro to protect hypoxic cardiomyocytes through paracrine action.

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R542.22

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