本文選題：綿羊KAP11.1 + 皮質(zhì)層�。� 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：在毛囊的形成過程中,毛母質(zhì)細(xì)胞向上分化成內(nèi)根鞘及毛干,毛干最后長出體表形成毛發(fā)。毛干由髓質(zhì)層、皮質(zhì)層、角質(zhì)層三部分組成,皮質(zhì)層是毛干的重要組成部分。絕大部分角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(Keratin associated protein,KAP)基因在皮質(zhì)層特異表達(dá),KAPs含量及與角蛋白互作形成的交聯(lián)結(jié)構(gòu)影響毛發(fā)的理化性質(zhì),進(jìn)而決定毛發(fā)的品質(zhì)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)綿羊角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白11.1(Keratin associated protein 11.1,KAP11.1)基因在毛囊皮質(zhì)層特異表達(dá),隨后利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型證實綿羊KAP11.1基因5’端上游5952bp序列能夠驅(qū)動外源基因在小鼠毛囊皮質(zhì)層特異性表達(dá)。但KAP11.1基因在毛囊皮質(zhì)層特異表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測、雙熒光素酶報告基因檢測、點突變、RNA干擾、EMSA、免疫熒光組化等技術(shù)對綿羊KAP11.1基因上游調(diào)控序列進(jìn)行了鑒定,并構(gòu)建了表達(dá)Cre重組酶的KAP11.1-Cre轉(zhuǎn)基因載體,主要研究結(jié)果如下:(一)綿羊KAP11.1基因5’端上游調(diào)控序列研究1.綿羊KAP11.1基因5’端上游序列中存在重要調(diào)控區(qū)域首先,對KAP11.1基因5’端2576bp上游序列(ATG的A為+1)進(jìn)行截短,共得到7個截短體,分別命名為F5(-2576~+1)、F6(-2099~+1)、F7(-1594~+1)、F8(-1026~+1)、F9(-569~+1)、F10(-251~+1)、F11(-148~+1)截短體。將各截短體克隆到雙熒光素酶報告載體并轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,檢測結(jié)果顯示F10截短體中可能存在影響綿羊KAP11.1基因表達(dá)的調(diào)控序列。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)F10截短體中的-251~-148bp區(qū)域存在三個與毛囊發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(Hoxc13、Tst-1/Oct6和Ets1)結(jié)合位點。其次,通過對預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進(jìn)行點突變、利用RNA干擾技術(shù)在體外細(xì)胞中抑制Hoxc13、Tst-1/Oct6、Ets1表達(dá)的策略證實這些結(jié)合位點對KAP11.1基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。2.綿羊KAP11.1基因上游-251~-148bp區(qū)域與候選轉(zhuǎn)錄因子存在互作依據(jù)-251~-148bp區(qū)域中Hoxc13、Tst-1/Oct6和Ets1結(jié)合位點設(shè)計探針,利用凝膠電泳遷移實驗(EMSA)驗證三個轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)合位點的互作,結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含Hoxc13、Tst-1/Oct6和Ets1三個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的序列與核蛋白形成了DNA-蛋白復(fù)合物,表明存在相互作用。3.綿羊KAP11.1基因上游-251~-148bp區(qū)域可能是一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域首先,采集毛囊處于生長期的綿羊及昆明小鼠皮膚制作切片,用免疫熒光組化技術(shù)檢測顯示Hoxc13、Tst-1/Oct6和Ets1在綿羊及小鼠毛囊皮質(zhì)層有表達(dá)。其次,本課題組前期研究中制備了用綿羊KAP11.1基因5’端上游5952bp序列驅(qū)動KAP13.1和ZSG表達(dá)的pKAP11.1-sKAP13.1-2A-ZSG小鼠(簡稱Plus小鼠)。本研究采集了出生后9(毛囊生長期)、15(毛囊生長末期)、18(毛囊衰退期)、21(毛囊退行期)天的Plus小鼠皮膚制作切片,免疫熒光組化結(jié)果表明Hoxc13、Tst-1/Oct6和Ets1在毛囊生長期的Plus小鼠毛囊皮質(zhì)層中高表達(dá),在衰退期及休止期不表達(dá)或低表達(dá),其時空表達(dá)模式與課題組前期研究中檢測的由綿羊KAP11.1基因5’端上游5952bp序列調(diào)控的KAP13.1表達(dá)模式一致。第三,對綿羊KAP11.1基因5’端上游5952bp序列中-251~-148bp區(qū)域的Ets1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進(jìn)行點突變,插入雙熒光素酶報告載體,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)KAP11.1基因5952bp上游序列的熒光素酶活性顯著降低,說明-251~-148bp區(qū)域可能是KAP11.1基因上游序列中的一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。(二)表達(dá)Cre重組酶的KAP11.1-Cre轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建利用本課題組前期研究中鑒定的可驅(qū)動外源基因在毛囊皮質(zhì)層特異表達(dá)的綿羊KAP11.1基因5952bp上游序列,構(gòu)建了表達(dá)Cre重組酶的KAP11.1-Cre載體并在三種細(xì)胞(HEK293T、BHK21和PK15)中超表達(dá),在細(xì)胞水平進(jìn)行了表達(dá)檢測,已經(jīng)用于KAP11.1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的制備。
[Abstract]:In this study , we identified the specific expression of KAP11 . 1 gene at 5 ' end of sheep KAP11.1 gene . The expression pattern of KAP11.1 - sKAP13.1 - sKAP13.1 - 2A - ZSG ( abbreviated Plus mouse ) , which was identified in the previous study of sheep KAP11.1 gene , was constructed .

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S826

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1785717