本文選題：飛蝗 + 蛻皮　； 參考：《山西大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：昆蟲表皮覆蓋整個(gè)蟲體,對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。幾丁質(zhì)是表皮的主要成分,其致密排列組裝成精細(xì)的表皮結(jié)構(gòu)。由于人類和高等動(dòng)物體內(nèi)不含幾丁質(zhì),因此表皮可做為害蟲防治的安全靶標(biāo)。表皮幾丁質(zhì)的有序排列對(duì)維持表皮結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要,表皮幾丁質(zhì)排列關(guān)鍵基因的篩選及功能研究將揭示表皮形成的分子機(jī)制,為害蟲防治靶標(biāo)的研究提供重要的理論依據(jù)。本文以飛蝗(Locusta migratoria)為研究材料,分別對(duì)3類幾丁質(zhì)排列關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能進(jìn)行探討。研究?jī)?nèi)容如下:一、飛蝗幾丁質(zhì)脫乙�；�(CDAs)基因鑒定和分子特性從飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索獲得的CDAs序列進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證、功能域分析并構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹,獲得4條CDAs的全長(zhǎng)cDNA序列,分別將其命名為L(zhǎng)mCDA1、LmCDA2、LmCDA4和LmCDA5,其中LmCDA2和LmCDA5分別具有2個(gè)剪切子,分別為L(zhǎng)mCDA2a和LmCDA2b及LmCDA5a和LmCDA5b。采用(reverse transcriptionquantitative PCR,RT-qPCR)技術(shù)對(duì)其分子特性進(jìn)行研究,對(duì)各組織部位CDAs表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明LmCDA1和LmCDA4在前腸表達(dá)量最高,在體壁和后腸次之。LmCDA2a和LmCDA2b在前腸的表達(dá)量顯著高于其他組織。LmCDA5在前腸中表達(dá)量最高,體壁、后腸和脂肪體次之。對(duì)5齡不同天數(shù)體壁CDAs表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明LmCDAs均在第1和2天表達(dá)量最高,隨著天數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì),而在蛻皮前表達(dá)量升高,暗示LmCDAs在飛蝗蛻皮前后發(fā)揮著重要作用。二、飛蝗幾丁質(zhì)脫乙�；�(CDAs)基因的生物學(xué)功能采用RNAi(RNA interference)技術(shù)對(duì)CDAs生物學(xué)功能進(jìn)行研究,結(jié)果表明分別注射CDAs的dsRNA(double-strand RNA)可以特異、高效的沉默靶標(biāo)基因,且注射dsLmCDA1、dsLmCDA2和dsLmCDA2a后,飛蝗出現(xiàn)難以蛻去舊表皮并最終導(dǎo)致死亡的表型,而注射dsLmCDA2b、dsLmCDA4和dsLmCDA5的蟲體可以成功蛻至下一齡期,未觀察到可見的異常表型。HE染色結(jié)果表明,與對(duì)照組相似,注射dsLmCDA1和dsLmCDA2后,飛蝗經(jīng)歷皮層溶離,新表皮合成加厚和舊表皮降解變薄的過程,無肉眼可見的表型。免疫組化結(jié)果表明,LmCDA2位于原表皮最上層,LmCDA1主要位于皮細(xì)胞層,此外在外表皮也有可見的熒光信號(hào)。殼聚糖染色結(jié)果表明,注射dsLmCDA1后,殼聚糖含量顯著降低,表明幾丁質(zhì)脫乙酰度降低,而注射dsLmCDA2后,與對(duì)照組相比,其殼聚糖含量不變,表明幾丁質(zhì)脫乙酰度未發(fā)生改變。透射電鏡觀察結(jié)果表明,注射dsLmCDA1后,仍舊可觀察到幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu),表皮變薄,而注射dsLmCDA2后,幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)消失,表皮變厚。將LmCDA1和LmCDA2同時(shí)沉默后,幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)消失,其表皮厚度介于分別將LmCDA1和LmCDA2沉默后的表皮厚度之間,表明LmCDA2在表皮幾丁質(zhì)排列中發(fā)揮重要功能,且LmCDA1和LmCDA2對(duì)表皮厚度的維持起著重要作用。幾丁質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果表明,注射dsLmCDA1后,表皮幾丁質(zhì)含量顯著降低,而注射dsLmCDA2后,表皮幾丁質(zhì)含量未發(fā)生變化,將LmCDA1和LmCDA2同時(shí)沉默后,幾丁質(zhì)含量顯著降低。上述結(jié)果表明LmCDA1和LmCDA2在功能上存在分化。三、飛蝗Knickkopf(Knk)基因的分子特性和生物學(xué)功能從飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中搜索獲得的LmKnk序列進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證,獲得LmKnk全長(zhǎng)cDNA序列。功能域分析結(jié)果表明,LmKnk包含三個(gè)保守功能域。聚類分析結(jié)果表明,LmKnk與其他昆蟲的Knk家族聚為一支,將其命名為L(zhǎng)mKnk。采用RT-qPCR對(duì)LmKnk進(jìn)行分子特性研究,不同組織部位表達(dá)結(jié)果表明,LmKnk在前腸中表達(dá)最高,其次在體壁中表達(dá)較高。對(duì)LmKnk在5齡不同天數(shù)體壁中表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明LmKnk在五齡整個(gè)若蟲期均有表達(dá)。預(yù)示LmKnk在5齡整個(gè)發(fā)育過程中起著重要作用。采用RNAi技術(shù)將合成的靶基因特異性的dsLmKnk注射到飛蝗體內(nèi),檢測(cè)dsLmKnk對(duì)LmKnk基因的沉默效率并對(duì)其表型進(jìn)行觀察,結(jié)果表明dsLmKnk可以高效地沉默靶基因。且注射dsLmKnk后在若蟲-若蟲和若蟲-成蟲期飛蝗均出現(xiàn)蛻皮困難而死亡的表型。HE染色結(jié)果表明,注射dsLmKnk后,飛蝗依舊經(jīng)歷皮層溶離和舊表皮降解變薄,但與對(duì)照相比,新表皮顯著變薄。采用幾丁質(zhì)染色實(shí)驗(yàn)對(duì)表皮中幾丁質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明新表皮中幾丁質(zhì)含量顯著下降。透射電鏡觀察結(jié)果表明,注射dsLmKnk后表皮致密排列的幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)消失,表皮變薄且孔道結(jié)構(gòu)畸形。對(duì)表皮幾丁質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,注射ds LmKnk后表皮幾丁質(zhì)含量降低。免疫組化結(jié)果表明LmKnk產(chǎn)生于皮細(xì)胞中,蛻皮時(shí)部分轉(zhuǎn)移至新表皮中,表明其可能參與對(duì)新表皮的保護(hù)。四、飛蝗Retroactive(Rtv)基因的分子特性和生物學(xué)功能將飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中已鑒定的LmRtv序列進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證,獲得LmRtv的全長(zhǎng)cDNA序列。檢測(cè)LmRtv在不同組織部位和不同天數(shù)體壁中的表達(dá),結(jié)果表明LmRtv在前腸中表達(dá)量最高,且在5齡第1和2天表達(dá)量最高。注射dsLmRtv后,飛蝗出現(xiàn)蛻皮困難而致死的表型。HE染色結(jié)果表明,注射dsLmRtv后飛蝗依舊出現(xiàn)皮層溶離和舊表皮的降解,但新合成的新表皮量顯著減少。透射電鏡觀察結(jié)果表明,注射dsLmRtv后新表皮片層結(jié)構(gòu)消失,孔道結(jié)構(gòu)膨大而不規(guī)則,表皮厚度與對(duì)照組相比顯著變薄。幾丁質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果表明,注射dsLmRtv后幾丁質(zhì)含量顯著降低。本文研究發(fā)現(xiàn),注射dsLmCDA1、dsLmCDA2、dsLmKnk和dsLmRtv后,均可導(dǎo)致飛蝗蛻皮困難而死亡的表型,且表型相似,難以將其區(qū)分開來。因此,進(jìn)一步借助顯微和超微技術(shù)對(duì)其進(jìn)行深入觀察,結(jié)果表明飛蝗出現(xiàn)蛻皮困難致死的原因不同,LmCDA1定位于皮細(xì)胞和外表皮,主要參與幾丁質(zhì)脫乙酰過程,維持表皮中幾丁質(zhì)與殼聚糖含量的平衡。LmCDA2位于原表皮的最外層,主要負(fù)責(zé)幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)的形成。LmKnk定位于新表皮中,負(fù)責(zé)新表皮幾丁質(zhì)的沉積和幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)的維持。而目前LmRtv的定位尚不清楚,其功能主要是參與新表皮幾丁質(zhì)的沉積,同時(shí)負(fù)責(zé)幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)的維持。綜上所述,本文系統(tǒng)地研究了表皮幾丁質(zhì)排列關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能,豐富了昆蟲表皮幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)研究?jī)?nèi)容,篩選獲得LmCDA1、LmCDA2、LmKnk和LmRtv表皮幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)有序排列關(guān)鍵基因,為害蟲綠色防控提供了潛在的分子靶標(biāo)。
[Abstract]:The results showed that LmCDA1 and LmCDA4 had the highest expression of CDAs . The results showed that LmCDA1 and LmCDA4 had the highest expression level in the anterior intestine . The results showed that LmCDA1 and LmCDA4 had the highest expression level in the anterior intestine . The results showed that LmCDA1 and LmCDA2 had no changes after injection of dsLmCDA1 . The results showed that LmCDA1 and LmCDA2 had no change after injection of dsLmCDA1 . The results showed that LmCDA1 and LmCDA2 had no change in the epidermal thickness . The results showed that LmRtv showed that LmRtv had the highest expression in the anterior intestine . The results showed that after injection of dsLmCDA1 , dsLmCDA2 , dsLmKnk and dsLmRtv , it was found that LmRtv had the highest expression of chitin and chitosan .

【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q963

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本文編號(hào)：1782220