本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花重組DNA在土壤中分布的實(shí)時(shí)定量PCR分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

1934李剛，等：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花重組DNA在土壤中分布的實(shí)時(shí)定量PCR分析

2012年10月

correlationcoefficientswereabove0.998withgoodrepeatability.Allthecopynumberof35S-Cry1Aand35S-nptⅡfragmentsatthethreerhizoplane>rhizosphere>non-rhizosphere,whichindicatedthatrecombinantDNAfragmentscon－growthstagesshowedthetrendasfollows：

centratedintherhizoplanesoil,followedbytherhizospheresoilandnon-rhizospheresoil.Duringthe60dgrowthperiod,thecopynumberofthe35S-Cry1Aand35S-nptⅡfragmentsincreasedwiththegrowingstages,andthedistributionareasgraduallyexpanded.Thecopynumberof35S-nptⅡfragmentwashigherthan35S-Cry1Afragmentinthesamegrowthstageandinthecorrespondingrootzone.Transgenicinsect-resistantcottonmayhavepotentialimpactontheenvironment.

Keywords：transgenicinsect-resistantcotton;recombinantDNA;realtimePCR;rhizoboxmethod;distribution

國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）公布

的最新數(shù)據(jù)表明，到2011年，全球轉(zhuǎn)基因作物的播種面積將達(dá)到1.6億hm2，種植面積增長近94倍，種植轉(zhuǎn)基因作物的國家從最初的6個(gè)將增加到29個(gè)[1]。隨著轉(zhuǎn)基因作物的大面積推廣和種植，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式產(chǎn)生了巨大變革，經(jīng)濟(jì)效益得到大幅度提高，但與此同時(shí)，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)生態(tài)環(huán)境的潛在安全風(fēng)險(xiǎn)引起了國際上的廣泛關(guān)注[2]。

目前研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物釋放的外源重組DNA可能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成潛在的影響，特別是土壤生態(tài)環(huán)

ep－境[3]。轉(zhuǎn)基因作物所轉(zhuǎn)入的外源基因（如Bt基因、

sps基因和nptⅡ基因）與微生物所攜帶的相關(guān)基因具有近緣關(guān)系，它們可通過植物根系分泌物、花粉、殘?bào)w等方式釋放到土壤環(huán)境中[4-5]，并可能被具有自然感受能力的微生物通過同源重組方式整合到基因組中，尤其是抗性篩選標(biāo)記基因片段，這種基因水平轉(zhuǎn)移很可能造成微生物群體結(jié)構(gòu)和功能的改變，甚至造成微生態(tài)環(huán)境的改變，其生態(tài)安全性已經(jīng)引起科學(xué)界的廣泛關(guān)注[6-10]。

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花是我國種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因2011年種植面積達(dá)到390萬hm2，占棉花總種作物，

植面積的71.5%。我國所種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花是通過導(dǎo)入外源抗蟲基因（Bt基因等），并以nptⅡ基因作為抗性篩選標(biāo)記基因而選育的[11]。隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花的大面積環(huán)境釋放，其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)日益受到人們的重視。目前已開展大量關(guān)于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)性的研究，主要在對(duì)農(nóng)田非靶標(biāo)害蟲、天敵及其他種類昆蟲的影響[12]，對(duì)土壤微生物多樣性的影響[13-14]，外源蛋白的殘留情況及動(dòng)態(tài)變化[15-19]，向葉圍微生物的基因轉(zhuǎn)移[11]及基因擴(kuò)散[20]等方面，但對(duì)土壤環(huán)境中轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花重組DNA的分布與動(dòng)態(tài)變化缺乏研究。本研究針對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花中與蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因具有

（c）和nptⅡ基因，根據(jù)其構(gòu)建特異近緣關(guān)系的Cry1A

性序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立熒光定量PCR方法，并

結(jié)合根盒法對(duì)3個(gè)生長時(shí)期不同根區(qū)土壤中35S-Cry1A和35S-nptⅡ片段進(jìn)行定量分析，首次對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花重組DNA在土壤中的時(shí)空分布變化進(jìn)行探索，豐富轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)研究內(nèi)容，為科學(xué)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花的生態(tài)安全性提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1供試材料

供試棉花品種為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花SGK321，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。供試土壤為潮土，取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院武清轉(zhuǎn)基因生物農(nóng)田生態(tài)環(huán)境影響野外科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，試驗(yàn)前種植玉米和小

kg-1，麥。部分理化性質(zhì)如下：有機(jī)質(zhì)含量10.69g·全

kg-1，kg-1，氮含量0.63g·全磷含量1.35g·硝態(tài)氮含量

36.38mgkg-1，kg-1。·銨態(tài)氮含量5.72mg·1.2根盒設(shè)計(jì)

試驗(yàn)中用于種植棉花的3室根盒由非透明有機(jī)玻璃加工制成，，長13cm、寬8cm、高12cm，植物生長

2個(gè)土壤室寬度均為5cm。植物生長室寬度為3cm，

室和2個(gè)土壤室之間用30μm孔徑的尼龍網(wǎng)相隔，將根系限制在植物生長室中生長，采集土壤樣品時(shí)便于將植物根系與土壤分離開（圖1）。播種前將取自試驗(yàn)站的新鮮土壤自然風(fēng)干，過1mm篩后裝入各根室，每盒裝土1.2kg。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)及土壤樣品采集

試驗(yàn)在網(wǎng)室內(nèi)進(jìn)行，于2010年5月30日播種，共12盒，每盒播種3粒，待出苗后定苗至1株。播種后第10d以（NH4）2SO4和KH2PO4混合液體的形式

kg-1、kg-1、施一次肥，施氮200mg·磷150mg·鉀188mgkg-1，·日常管理過程中不噴灑農(nóng)藥，用稱重法補(bǔ)充

水分，使土壤含水量保持在17%左右。液體肥料與水均添加至植物生長室中。

50d和60d于棉花3個(gè)生長期（播種后40、）采

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