本文選題：綿羊 + 睪丸組織�。� 參考：《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：【目的】⑴驗(yàn)證POU5F1(POU domain,class 5,transcription factor 1)、SOX2[SRY(sex determining region Y)-box 2]、KLF4[Kruppel-like factor 4(gut)]和MYC(myelocytomatosis oncogene)基因在綿羊睪丸組織中的表達(dá)方式并克隆表達(dá)的m RNA序列。構(gòu)建攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達(dá)載體,為將來(lái)獲得綿羊Leydig細(xì)胞源誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,i PSC)系提供物質(zhì)基礎(chǔ)。⑵用HSD3B染色方法確定成年小鼠Leydig細(xì)胞的體外生長(zhǎng)形態(tài)特征,為更好地鑒別體外培養(yǎng)的綿羊Leydig細(xì)胞提供技術(shù)基礎(chǔ)�！痉椒ā竣呕パa(bǔ)DNA模板來(lái)源于1周齡和6月齡大的湖羊的睪丸組織,通過(guò)RT-PCR和測(cè)序分別驗(yàn)證了POU5F1、SOX2、KLF4和MYC基因在綿羊睪丸中的表達(dá)方式以及分別對(duì)表達(dá)的m RNA進(jìn)行分子克隆。⑵基因組模板來(lái)自培養(yǎng)的30-40妊娠日齡的蒙古綿羊的胎兒成纖維細(xì)胞,通過(guò)PCR和測(cè)序驗(yàn)證綿羊KLF4的基因組序列。⑷構(gòu)建4個(gè)攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達(dá)載體,分別為p MXs-o POU5F1、p MXs-o SOX2、p MXs-o KLF4和p MXs-o MYC質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶酶切法和測(cè)序法驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒序列的正確性。⑸將參照組的p MXs-GFP質(zhì)粒和構(gòu)建的4個(gè)質(zhì)粒運(yùn)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染入Phoenix Amphotropic細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染48 h和72 h后,在熒光條件下觀察p MXs-GFP的轉(zhuǎn)染效果,并對(duì)培養(yǎng)的新生綿羊的Leydig細(xì)胞進(jìn)行感染。細(xì)胞感染4 d后,在熒光條件下觀察p MXs-GFP質(zhì)粒對(duì)綿羊Leydig細(xì)胞的感染效果,并用RT-PCR法驗(yàn)證這4個(gè)質(zhì)粒攜帶基因的外源表達(dá)情況。⑹2月齡大的小鼠睪丸,剝離白膜后,用膠原酶消化獲得Leydig細(xì)胞。Leydig細(xì)胞通過(guò)HSD3B染色方法鑒定�！窘Y(jié)果】⑴POU5F1在新生的和性成熟的湖羊睪丸中均表達(dá)。綿羊POU5F1的m RNA包含了一個(gè)1080 bp的開放閱讀框(open reading frame,ORF),編碼了359個(gè)氨基酸。綿羊POU5F1含有1個(gè)POU結(jié)構(gòu)域和1個(gè)homeobox結(jié)構(gòu)域。綿羊POU5F1蛋白第206位的賴氨酸和第207位的纈氨酸的序列是物種特異的,其它的哺乳動(dòng)物在此對(duì)應(yīng)的賴氨酸和纈氨酸位點(diǎn)之間還有一個(gè)色氨酸。⑵SOX2在新生的和性成熟的湖羊睪丸中均表達(dá)。綿羊SOX2的m RNA含有一個(gè)963 bp的ORF,編碼了320個(gè)氨基酸。綿羊SOX2含有1個(gè)HMG(high mobility group)結(jié)構(gòu)域。⑶MYC在新生的綿羊睪丸中表達(dá)。綿羊MYC的m RNA包含了一個(gè)1320 bp的ORF,編碼了439個(gè)氨基酸。綿羊MYC含有1個(gè)HLH(helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)域。⑷綿羊KLF4基因組從起始密碼子到終止密碼子的序列長(zhǎng)度為3159bp,含有一個(gè)1434 bp的ORF,編碼了477個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。綿羊KLF4基因含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。綿羊KLF4蛋白在肽鏈的碳端有3個(gè)C2H2(cysteine2/histidine2)型的鋅指。POU5F1、SOX2、KLF4和MYC氨基酸序列分析表明綿羊與牛有著最近的進(jìn)化關(guān)系,與靈長(zhǎng)類和嚙齒類有著相對(duì)較遠(yuǎn)的進(jìn)化關(guān)系。SOX2和KLF4蛋白的氨基酸序列在綿羊和牛中是100%的一致。⑸限制性內(nèi)切酶酶切法和測(cè)序法驗(yàn)證了構(gòu)建的p MXs-o POU5F1、p MXs-o SOX2、p MXs-o KLF4和p MXs-o MYC質(zhì)粒序列的正確性。通過(guò)用p MXs-GFP質(zhì)粒做對(duì)照,預(yù)測(cè)這4個(gè)構(gòu)建的質(zhì)粒能夠在AMPHO細(xì)胞系中有效地轉(zhuǎn)染。RT-PCR結(jié)果表明,這4個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒攜帶的外源基因均能夠在綿羊Leydig細(xì)胞基因組中整合并轉(zhuǎn)錄。⑹HSD3B染色鑒定后表明,培養(yǎng)48 h的成年小鼠Leydig細(xì)胞,在光學(xué)顯微鏡下能夠清晰地分辨出Leydig細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。Leydig細(xì)胞的細(xì)胞核大而圓;細(xì)胞質(zhì)布滿了致密的脂滴,細(xì)胞質(zhì)折光性強(qiáng)。Leydig細(xì)胞培養(yǎng)5 d后,細(xì)胞充分伸展,形態(tài)多樣。一些細(xì)胞聚集生長(zhǎng),一些細(xì)胞單獨(dú)生長(zhǎng)。聚集生長(zhǎng)的各個(gè)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞的觸角(cellular tentacles)相互聯(lián)系,形成了表皮樣的外貌。RT-PCR結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)5 d的Leydig細(xì)胞能夠表達(dá)Leydig細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄,包括HSD3B6、CYP17A1和St AR。【結(jié)論】新生湖羊的睪丸組織能夠表達(dá)POU5F1、SOX2和MYC基因,但不表達(dá)KLF4基因。獲得了綿羊POU5F1、SOX2和MYC基因的編碼區(qū)的m RNA序列,以及獲得了蒙古綿羊KLF4的基因組序列。構(gòu)建了有效的攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達(dá)載體,分別為p MXs-o POU5F1、p MXs-o SOX2、p MXs-o KLF4和p MXs-o MYC。鑒定了體外培養(yǎng)的成年小鼠Leydig細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)特征,為將來(lái)更好地鑒定體外培養(yǎng)的綿羊Leydig細(xì)胞提供技術(shù)基礎(chǔ)。這些研究結(jié)果可為將來(lái)獲得綿羊Leydig細(xì)胞源i PSCs打下基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective : ( 1 ) To verify the expression of POU5F1 ( POU domain , class 5 , transcription factor 1 ) , SOX2 sarcoma SRY ( sex determining region Y ) - box 2 mutants , KLF4 and kLF4 - ruppel - like factor 4 ( gut ) sarcoma and MYC ( . ) gene in sheep testis tissue and to clone the expressed m RNA sequence . The expression of pMXs - GFP plasmid in sheep ' s testis was verified by RT - PCR and sequencing . The amino acid sequence of sheep ' s POU5F1 contains one HLH ( helix - loop - helix ) domain . The sheep ' s KLF4 protein contains one HLH ( helix - loop - helix ) domain . The sheep KLF4 protein has three C2H2 ( helix - loop - helix ) domains . In this paper , the sequences of POU5F1 , SOX2 and MYC genes were expressed , but the KLF4 gene was not expressed . The gene sequences of sheep POU5F1 , SOX2 and MYC were obtained .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S826
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本文編號(hào)：1767395