本文選題：大猿葉蟲 + 滯育準(zhǔn)備期�。� 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：滯育是昆蟲應(yīng)對外界不良環(huán)境變化而產(chǎn)生的一種生長發(fā)育停滯的狀態(tài)。然而,昆蟲滯育并不是一種完全停滯的狀態(tài),包含滯育誘導(dǎo)、準(zhǔn)備、啟動、維持、解除和滯育后的靜息等幾個動態(tài)的生理階段。充分的滯育準(zhǔn)備對昆蟲滯育維持、解除和滯育后的發(fā)育等過程至關(guān)重要。注定滯育個體在滯育準(zhǔn)備期傳遞滯育誘導(dǎo)期積累的環(huán)境信號,“決定”個體是否進(jìn)入滯育;同時,相比生殖個體,注定滯育個體在滯育準(zhǔn)備期積累更多的營養(yǎng)物質(zhì)。然而,目前對注定滯育個體在滯育準(zhǔn)備期重要生理事件的分子調(diào)控機制尚未明確。大猿葉蟲Colaphellus bowringi Baly是一種十字花科蔬菜上的重要鞘翅目害蟲,具兼性滯育特性,以成蟲滯育入土越夏和越冬,溫度和光周期是誘導(dǎo)大猿葉蟲滯育的主要環(huán)境因子。大猿葉蟲幼蟲期是其滯育誘導(dǎo)敏感階段,25°C時,羽化成蟲取食4天左右為滯育準(zhǔn)備期,鉆土行為易于滯育辨別,是研究滯育準(zhǔn)備期分子調(diào)控機制的良好材料。本研究以大猿葉蟲修水種群(29°1′N,114°4′E)為研究對象,構(gòu)建了大猿葉蟲轉(zhuǎn)錄組Unigene數(shù)據(jù)庫,篩選出不同條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)和RNA-Seq技術(shù)鑒定了大猿葉蟲滯育準(zhǔn)備期差異表達(dá)的蛋白和基因,結(jié)合RNA干擾(RNA interference,RNAi)和添加外源保幼激素(juvenile hormone,JH)等方法分析了滯育準(zhǔn)備期主要生理事件的分子調(diào)控機制。主要結(jié)論如下:1.大猿葉蟲轉(zhuǎn)錄組Unigene數(shù)據(jù)庫構(gòu)建和實時定量PCR內(nèi)參基因篩選大猿葉蟲基因組信息的缺乏和有效內(nèi)參基因的不確定限制了對其分子調(diào)控機制的研究,因此,本研究構(gòu)建了大猿葉蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫、篩選了有效內(nèi)參基因。利用Illumina測序平臺,共獲得5.7′106多個reads,組裝成39,390個特異序列,平均長度為792 bp。24,070個Unigenes可注釋出明確生物學(xué)功能,占總Unigenes數(shù)目的61.11%。COG功能分析顯示,9,048個序列的預(yù)測蛋白歸屬25個生物學(xué)功能類別。KEGG數(shù)據(jù)庫比對分析顯示,16,951個序列參與了255個代謝通路。RT-PCR驗證了11個候選內(nèi)參基因(GAPDH,RPL32e,RPL19,EF1α,TBP,TBP1,ACT1,ACT2,αTUB,αTUB1,βTUBC)的序列,qRT-PCR分析了這11個候選內(nèi)參基因在不同發(fā)育階段、組織、性別、品系和光周期條件下的表達(dá),發(fā)現(xiàn)RPL19、EF1α和ACT1是不同實驗處理下表達(dá)最穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因,RPL19和ACT1可作為內(nèi)參基因用于大猿葉蟲滯育準(zhǔn)備期基因表達(dá)的研究。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建和有效內(nèi)參基因的篩選為后續(xù)大猿葉蟲滯育準(zhǔn)備期的分子調(diào)控機制研究提供了有效數(shù)據(jù)平臺。2.大猿葉蟲滯育準(zhǔn)備起始期差異蛋白鑒定和FABP功能分析滯育誘導(dǎo)信號主要在注定滯育個體的頭部被感知和儲存,脂質(zhì)代謝通路可能是將滯育誘導(dǎo)信息轉(zhuǎn)運到滯育準(zhǔn)備期的潛在通路。因此,本研究鑒定了大猿葉蟲滯育準(zhǔn)備起始期頭部差異表達(dá)的蛋白,并分析了脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding protein,FABP)在滯育準(zhǔn)備期的功能。采用iTRAQ技術(shù)共鑒定到大猿葉蟲雌成蟲頭部表達(dá)的蛋白3,175個,共獲得差異表達(dá)蛋白297個,滯育準(zhǔn)備起始期上調(diào)表達(dá)的蛋白141個,下調(diào)表達(dá)的蛋白156個。COG功能分析顯示,大量上調(diào)表達(dá)蛋白聚類到“能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換”、“碳水化合物代謝和運輸”以及“脂質(zhì)代謝”等代謝功能類別。KEGG分析顯示,FABP同時注釋到“peroxisome proliferator-activated receptor信號”和“脂肪消化和吸收”通路。滯育準(zhǔn)備起始期,RNAi沉默F(xiàn)ABP后,注定滯育個體脂肪體膨大受到抑制、脂肪體組織變得松散、脂滴含量減少,同時,Heat shock proteins 21(Hsp21)和Hsp23的mRNA水平顯著下調(diào)。滯育準(zhǔn)備起始期差異蛋白的鑒定和FABP的功能分析說明,脂質(zhì)代謝信號在滯育準(zhǔn)備起始期已被激活,脂質(zhì)代謝信號參與滯育準(zhǔn)備期脂質(zhì)積累的同時調(diào)控了抗逆基因Hsps的轉(zhuǎn)錄。3.JH信號調(diào)節(jié)大猿葉蟲滯育準(zhǔn)備的營養(yǎng)代謝基因轉(zhuǎn)錄前期研究已證實,內(nèi)分泌系統(tǒng)中的JH信號可調(diào)控大猿葉蟲注定滯育個體的生殖和滯育。然而,JH信號是否可通過調(diào)控注定滯育個體滯育準(zhǔn)備期的營養(yǎng)物質(zhì)代謝,從而調(diào)控其生殖和滯育還不清楚。本研究采用RNA-Seq技術(shù)鑒定了滯育準(zhǔn)備期和產(chǎn)卵前期的差異表達(dá)基因(differential expression genes,DEGs),結(jié)果表明,羽化后取食0到2天,注定滯育和注定非滯育個體中DEGs的數(shù)目均在800-1300個之間;而羽化后取食第2到第4天,注定非滯育個體中的DEGs上調(diào)173個、下調(diào)152個,注定滯育個體中的DEGs上調(diào)2576個,下調(diào)1998個,暗示滯育準(zhǔn)備期生理調(diào)控的復(fù)雜性。KEGG聚類分析顯示,差異基因主要聚集在碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白等代謝通路,表明營養(yǎng)代謝調(diào)控是產(chǎn)卵前期和滯育準(zhǔn)備期的主要特征�；虮磉_(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),糖酵解和磷酸戊糖途徑、脂肪酸合成與甘油酯代謝途徑在滯育準(zhǔn)備期更活躍,而核糖體途徑則在產(chǎn)卵前期更為活躍,這些結(jié)果很好地吻合了生殖與滯育個體的營養(yǎng)代謝特征。對JH合成與降解途徑的分析表明,JH信號在產(chǎn)卵前期被激活,而在滯育準(zhǔn)備期處于靜息狀態(tài)。添加外源JH和RNAi沉默JH受體methoprene-tolerant(Met)實驗顯示,JH通過受體Met調(diào)控產(chǎn)卵前期和滯育準(zhǔn)備期營養(yǎng)代謝相關(guān)基因的表達(dá)。JH-Met信號抑制注定滯育個體的碳水化合物和脂質(zhì)合成,促進(jìn)注定滯育個體的蛋白合成,進(jìn)而調(diào)控了生殖發(fā)育和滯育準(zhǔn)備。4.FAS2調(diào)節(jié)大猿葉蟲滯育準(zhǔn)備期的脂質(zhì)積累和抗逆基因表達(dá)目前,已證實脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)調(diào)節(jié)了昆蟲滯育過程中的脂質(zhì)積累。然而,FAS調(diào)節(jié)的脂質(zhì)積累是否影響滯育的其他方面還不清楚,如抗逆能力、滯育準(zhǔn)備持續(xù)期和滯育發(fā)生等。通過比對大猿葉蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,鑒定到兩個FAS基因序列。蛋白序列功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示FAS1蛋白序列包含7個功能結(jié)構(gòu)域,而FAS2包含9個功能結(jié)構(gòu)域;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示FAS1和FAS2分屬2個不同支。在滯育準(zhǔn)備期,FAS2的mRNA水平變化較之FAS1更明顯,取食2天后,FAS2的mRNA表達(dá)顯著高于FAS1;取食2天后,注定滯育個體FAS2的mRNA表達(dá)顯著高于注定非滯育個體FAS2的表達(dá)。這些結(jié)果暗示著,較之FAS1,FAS2在滯育準(zhǔn)備期發(fā)揮著更重要的功能。在滯育準(zhǔn)備期,RNAi沉默F(xiàn)AS2后,注定滯育個體脂肪體膨大受到抑制、脂肪體組織變得松散、甘油三酯含量減少;超氧化物歧化酶(superoxyde dismutase)的mRNA表達(dá)顯著下降、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase)的mRNA表達(dá)顯著上升;滯育個體的含水量升高。然而,沉默F(xiàn)AS2對滯育準(zhǔn)備持續(xù)期和滯育發(fā)生無顯著影響。添加外源JH和RNAi沉默JH受體Met表明,JH-Met信號通路抑制FAS2的轉(zhuǎn)錄。綜合可知,JH-Met信號的缺乏可誘導(dǎo)FAS2的表達(dá),促進(jìn)注定滯育個體的脂質(zhì)積累,調(diào)節(jié)其抗逆基因表達(dá)和含水量變化。本研究構(gòu)建了大猿葉蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫、篩選出有效內(nèi)參基因,為大猿葉蟲基因功能研究提供了有效數(shù)據(jù)平臺。鑒定到大量滯育準(zhǔn)備期差異表達(dá)的蛋白和基因,明確了JH-Met信號可通過對營養(yǎng)物質(zhì)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)而調(diào)控大猿葉蟲的生殖發(fā)育和滯育準(zhǔn)備,發(fā)現(xiàn)滯育準(zhǔn)備過程的脂質(zhì)積累可調(diào)節(jié)抗逆基因表達(dá)和含水量變化。研究結(jié)果豐富了基因組資源,為研究大猿葉蟲滯育調(diào)控的分子機制提供了基礎(chǔ)資料,為解析大猿葉蟲滯育準(zhǔn)備期的分子調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ),為揭示昆蟲滯育的分子調(diào)控機制提供了線索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S433.5

【參考文獻(xiàn)】

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5 王滿V，

本文編號：1743099