本文選題：煙草 + 生理生化指標(biāo)��； 參考：《云南師范大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：煙草是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物,也是云南省的支柱產(chǎn)業(yè),作為一種典型的喜溫作物,其整個生長發(fā)育期對水分需求很敏感。干旱和低溫是影響煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的重要逆境因素,因此準(zhǔn)確地鑒定并篩選出抗性優(yōu)良的煙草品種是亟待解決的生產(chǎn)難題。本研究首先通過生理生化指標(biāo)測定和隸屬函數(shù)統(tǒng)計分析法,對六個煙草品種的抗旱性和抗低溫性進(jìn)行綜合評價,為煙草的抗性品種選育和生產(chǎn)提供指導(dǎo)信息。作為新興的能源植物之一,小桐子所具備的種子含油量高、油質(zhì)優(yōu)良等特性使其備受關(guān)注,尤其是它能夠在極端氣候和土壤條件下生長,表現(xiàn)出對干旱、低溫和鹽分等脅迫因子具有一定的耐受性。因此,闡明小桐子對不同逆境脅迫耐受性形成的生理生化及分子機(jī)理,將極大地推動小桐子的抗逆遺傳工程改良。本實驗室前期借助Illumina高通量測序獲得了三個抗性相關(guān)基因基因JcP5CR、JcERF、JcSP1,基于此,本研究成功克隆獲得其完整編碼區(qū)序列,并構(gòu)建了植物表達(dá)載體,通過在煙草中的過量表達(dá),對轉(zhuǎn)基因煙草株系的耐逆性進(jìn)行分析,初步驗證了不同抗性相關(guān)基因在耐逆性形成中的作用,為小桐子抗逆性遺傳改良提供了重要的基因資源。通過研究得到以下主要結(jié)果:1.六個不同煙草品種的抗旱性和抗冷性的比較篩選和綜合評價對六個煙草品種在苗期分別進(jìn)行空氣干旱或4℃低溫脅迫處理,對葉片的多重脅迫傷害指標(biāo)和抗性指標(biāo)進(jìn)行測定,包括電導(dǎo)率、丙二醛、含水量、脯氨酸、可溶性糖含量,最終運(yùn)用隸屬函數(shù)法綜合評定出六個品種的抗旱性和抗低溫性分別進(jìn)行綜合評價.發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下單育2號平均隸屬函數(shù)值最高,為7.48,其次為云煙85,為5.04,而云煙116的抗旱性最差,為1.62;低溫旱脅迫下單育2號平均隸屬函數(shù)值最高,為0.72,其次為云煙85,為0.707,而Yatas-6的抗低溫性最差,為0.263。2.小桐子JcP5CR基因在煙草中過表達(dá)耐逆性研究克隆獲得JcP5CR基因的完整編碼區(qū)(CDS),全長828 bp,編碼蛋白由270個氨基酸組成。以10%PEG模擬干旱脅迫處理小桐子幼苗48 h,通過實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),隨著脅迫時間的增長,小桐子葉片中JcP5CR基因的轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)升高,到48 h時達(dá)到了對照(未經(jīng)脅迫)的8.73倍。將JcP5CR基因片段亞克隆至雙元植物表達(dá)載體pBI121,經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化模式植物煙草(Nicotiana tabacum Xanthi),獲得過表達(dá)JcP5CR的陽性植株。對脯氨酸含量的測定顯示,野生型煙草的脯氨酸含量約為18.56 ug.g~(-1),為轉(zhuǎn)基因株系的87%;經(jīng)空氣干旱脅迫3 d后,轉(zhuǎn)基因煙草葉片中脯氨酸含量達(dá)到9.14mg.g~(-1),為野生型的0.33倍。對T1代種子在脅迫下的發(fā)芽率進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)在低溫(12℃)處理10天后,野生型煙草的種子發(fā)芽率僅為70%,而轉(zhuǎn)基因株系的種子發(fā)芽率達(dá)到98.5%;在PEG脅迫15天后,野生型煙草的種子發(fā)芽率僅為35.6%,而轉(zhuǎn)基因株系的種子發(fā)芽率達(dá)到71.4%,表現(xiàn)出低溫和高鹽耐受性的升高。3.小桐子JcERF基因的克隆及轉(zhuǎn)基因煙草的耐逆性分析克隆獲得一個小桐子ERF類轉(zhuǎn)錄因子,其CDS區(qū)為729 bp,對推測的編碼蛋白進(jìn)行保守功能域搜索,顯示含有保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。對其啟動子區(qū)域進(jìn)行功能元件預(yù)測,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄起始位點上游1500 bp處存在ERF響應(yīng)元件(ERE)。構(gòu)建雙元植物表達(dá)載體pBI121-JcERF,并獲得過表達(dá)JcERF的陽性煙草植株,并對T1代轉(zhuǎn)基因株系對高鹽和低溫脅迫下的耐受性進(jìn)行初步分析。結(jié)果顯示,將轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉盤置于不同濃度NaCl溶液中進(jìn)行失綠分析,發(fā)現(xiàn)第三天約30%的野生型葉片已明顯白化,而轉(zhuǎn)基因煙草葉片還未出現(xiàn)白化,表現(xiàn)耐鹽性的升高。經(jīng)低溫脅迫(0℃)處理24 h后,轉(zhuǎn)基因煙草的電解質(zhì)滲透率僅為野生型煙草的0.69%,而脯氨酸和可溶性糖含量至少達(dá)到野生型的3.82倍和1.72倍。對T1代煙草種子在低溫12℃下的萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)脅迫15天后,轉(zhuǎn)基因煙草種子的發(fā)芽率高達(dá)野生型3.89倍。這些結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄因子JcERF的過表達(dá)賦予轉(zhuǎn)基因煙草對高鹽和低溫脅迫較強(qiáng)的耐受性。4.小桐子JcSP1基因在煙草中過表達(dá)耐逆性研究在實驗室前期的的研究基礎(chǔ)上,獲得過表達(dá)JcSP1的轉(zhuǎn)基因煙草植株。經(jīng)過對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行48h的高溫脅迫處理,轉(zhuǎn)基因煙草葉片的相對電導(dǎo)率只有野生型煙草葉片相對電導(dǎo)率的87.56%;轉(zhuǎn)基因煙草葉片和野生型煙草葉片的可溶性糖含量及可溶性蛋白含量都有顯著上升,可溶性糖含量和可溶性蛋白分別高于野生型煙草葉片0.57倍、0.14倍,表現(xiàn)出較強(qiáng)的高溫耐受性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：云南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;S572;S794.9

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本文編號：1732210