本文選題：牛傳染性鼻氣管炎　切入點(diǎn)：氣溶膠檢測方法　出處：《石河子大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3,BPIV3)均為牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)的重要病原。牛呼吸道疾病綜合征是一個嚴(yán)重阻礙世界養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的疾病,具有很高的感染率和死亡率。IBRV是雙鏈DNA病毒,基因組為130 kb左右,可允許外源基因插入,是重組活載體疫苗的候選病毒載體,已有很多外源病毒基因成功地插入到了IBRV基因組中。牛副流感病毒3型,是引起犢牛肺炎的主要病原之一,引起的感染在世界范圍內(nèi)流行。牛副流感病毒3型的HN基因是病毒主要的誘導(dǎo)中和抗體的保護(hù)性抗原,被廣泛應(yīng)用于疫苗研究,如重組腺病毒載體疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗及納米顆粒疫苗。因此,構(gòu)建攜帶BPIV3 HN基因的重組IBRV活載體疫苗,可同時防控牛呼吸道疾病綜合征中的IBRV和BPIV3的混合感染,起到一苗雙防的效果。目的:牛傳染性鼻氣管炎可通過空氣傳播,其傳播速度快、距離遠(yuǎn)、效率高,難以防御。隨著集約化、規(guī)模化畜牧生產(chǎn)的發(fā)展,IBRV氣溶膠在流行病傳播中占據(jù)重要地位。(1)建立牛傳染性鼻氣管炎群體監(jiān)測技術(shù),為傳染病風(fēng)險(xiǎn)評估及預(yù)報(bào)預(yù)警提供配套技術(shù);(2)構(gòu)建牛傳染性鼻氣管炎病毒活載體;(3)制備牛副流感病毒3型HN蛋白的多克隆抗體,為重組病毒的鑒定提供物質(zhì)支撐;(4)構(gòu)建攜帶牛副流感病毒3型HN基因的牛傳染性鼻氣管炎重組病毒,為IBRV和BPIV3的防控奠定基礎(chǔ)。方法:(1)通過常規(guī)PCR,克隆IBRV g D基因,并將其連入p EASY-T3載體中,獲得陽性重組質(zhì)粒。對SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增程序中的熒光染料濃度、引物濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了可用于養(yǎng)殖場環(huán)境中氣載牛傳染性鼻氣管炎病原檢測方法,并對規(guī)�；膛鲞M(jìn)行氣溶膠樣本的持續(xù)監(jiān)測。(2)利用p EGFP-N1和IBRV DNA為模板,獲得GFP表達(dá)盒和TK(g E)基因上下游片段,經(jīng)拼接獲得獲得含GFP表達(dá)盒且打靶基因缺失的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與IBRV基因組DNA共轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞,經(jīng)同源重組獲得IBRV活載體。(3)以BPIV3的基因組為模板,采用RT-PCR方法獲得HN基因,構(gòu)建HN基因原核表達(dá)載體。經(jīng)誘導(dǎo)、純化獲得融合蛋白。將純化的重組蛋白免疫新西蘭兔,制備多克隆抗體,評估其誘導(dǎo)中和抗體的能力。(4)以IBRV DNA和BPIV3 DNA為模板,構(gòu)建含HN表達(dá)盒的g E基因缺失轉(zhuǎn)移載體。將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與IBRV g E-/EGFP+活載體基因組DNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,經(jīng)同源重組獲得攜帶HN基因的IBRV重組病毒。結(jié)果:(1)通過對SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR條件的優(yōu)化,最佳擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL:2×SYBR Premix Ex Taq II 10μL,模板2μL,上游引物和下游引物(0.25μmol/L)各0.5μL,RNase Free dd H2O 7μL。最佳反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃30s,然后按照95℃變性5s、63℃退火延伸30s進(jìn)行40個循環(huán);溶解曲線為95℃5s、65℃60s、95℃Continuous;最后50℃30s結(jié)束反應(yīng)。溫度轉(zhuǎn)換率為20℃/s。在每個循環(huán)的延伸結(jié)束時進(jìn)行熒光信號檢測。用建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法對BVDV、BPIV-3、BCo V、BRV進(jìn)行檢測,這些病原核酸的檢測均為陰性。該檢測可檢出核酸的最低模板拷貝數(shù)為101拷貝/μL,而常規(guī)PCR所能檢出的核酸的最低陽性質(zhì)�？截悢�(shù)分別為102拷貝/μL。對7個規(guī)�；膛鲞M(jìn)行氣溶膠樣本的持續(xù)監(jiān)測,檢測了247份樣本,有2個牧場多次監(jiān)測到牛傳染性鼻氣管炎病毒核酸陽性,與個體檢測數(shù)據(jù)相符。(2)利用p EGFP-N1和IBRV DNA為模板,通過PCR獲得了GFP表達(dá)盒、TK基因上下游片段、g E基因上下游片段。通過重疊PCR、酶切、回收目的片段、連接和轉(zhuǎn)化等技術(shù)手段,最終獲得含GFP表達(dá)盒的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pc DNA3.1-TKup-GFP-TKdown和pc DNA3.1-g Eup-GFP-g Edown。將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與IBRV基因組DNA共轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞,利用綠色熒光蛋白和病毒蝕斑克隆篩選,獲得了IBRV活載體,PCR檢測結(jié)果表明GFP基因已經(jīng)插入到了重組病毒IBRV的基因組中。(3)利用BPIV3的基因組作為模板,擴(kuò)增HN,構(gòu)建原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),確定IPTG誘導(dǎo)最佳濃度為1mmol/L,最佳誘導(dǎo)溫度為37℃,最佳誘導(dǎo)時間為6h。誘導(dǎo)、純化后,經(jīng)Pierce BCA Protein Assay Kit測定蛋白濃度為412μg/ml。將純化后的BPIV3病毒蛋白HN蛋白和p ET32a(+)空載蛋白與等體積的弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑乳化,免疫新西蘭兔,獲得的效價高、特異性強(qiáng)的抗血清。(4)以IBRV DNA為模板,獲得g E基因上下游片段。經(jīng)重疊PCR獲得片段g Eup-HN-g Edown,將其插入載體pc DNA3.1(+)中,構(gòu)建了含HN表達(dá)盒的g E基因缺失轉(zhuǎn)移載體pc DNA3.1-g Eup-HN-g Edown。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將該轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與IBRV g E-/EGFP+突變株基因組DNA共轉(zhuǎn)染MDBK,采用反向病毒蝕斑篩選法,獲得了IBRV g E-/HN+突變株。PCR鑒定結(jié)果表明HN基因在重組病毒中穩(wěn)定存在。利用制備的多克隆抗體作為一抗進(jìn)行檢測,結(jié)果表明HN基因已表達(dá)。病毒滴度測定結(jié)果表明,重組病毒的增殖能力與親本病毒相似。結(jié)論:(1)建立并優(yōu)化了奶牛場環(huán)境氣溶膠群體監(jiān)測技術(shù),為傳染病風(fēng)險(xiǎn)評估及預(yù)報(bào)預(yù)警提供配套技術(shù)。對規(guī)模化奶牛場進(jìn)行氣溶膠樣本的持續(xù)監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)牛群中帶毒牛和隱性感染牛的存在,為牛傳染性鼻氣管炎的早期預(yù)警及群體監(jiān)測提供了關(guān)鍵技術(shù)。(2)構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白GFP的IBRV活載體,為IBRV活載體疫苗的研究提供物質(zhì)支撐。(3)構(gòu)建了BPIV3 HN基因的原核表達(dá)載體,利用p ET32a原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了較純的重組蛋白,免疫新西蘭兔后可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體血清。(4)成功構(gòu)建了攜帶HN基因的IBRV重組病毒,Western blotting證實(shí)HN基因在重組病毒感染的細(xì)胞中獲得了表達(dá)。TCID50測定結(jié)果表明,重組病毒和親本病毒之間的增殖能力差別相似�？傊�,本研究建立了敏感性好、特異性強(qiáng)的IBR氣溶膠熒光定量PCR方法,為評估牛場是否存在IBR持續(xù)感染或隱性帶毒牛提供技術(shù)支持,同時也為牛場提供預(yù)報(bào)預(yù)警信息;構(gòu)建了攜帶BPIV3 HN基因的IBRV g E-/HN+,為我國牛呼吸道疾病綜合征的防控提供支持。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1728278