本文選題：M26　切入點：低氮脅迫　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2017年碩士論文

【摘要】：植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CYS)是在植物體內(nèi)能可逆地抑制半胱氨酸蛋白酶活性的一類蛋白家族。CYS基因已在擬南芥、水稻、大豆等多種植物中被鑒定,并揭示了該類基因在不同物種中的結構特征和生物學功能。蘋果屬于喜硝植物,氮脅迫會嚴重影響蘋果的生長發(fā)育、果實品質和產(chǎn)量。有關蘋果CYS基因在氮脅迫下的功能研究,尚未見報道。本課題前期鑒定了蘋果cystatins基因家族成員,在富平楸子中克隆出MpCYS4基因(即Md CYS21),并獲得過表達MpCYS4基因的M26轉基因植株。本研究在此基礎上,系統(tǒng)的分析了蘋果CYS基因在低氮脅迫下的表達的變化。采用組培、沙培和水培的實驗手段研究了MpCYS4轉基因植株對低氮脅迫的抗性。獲得如下結果:1、蘋果砧木M26低氮脅迫處理的結果表明:低氮處理顯著抑制了M26的生長。低氮處理組M26的干重、株高、莖粗、葉綠素含量、凈光合速率等指標顯著小于對照組,植株表現(xiàn)出典型的缺氮癥狀。在課題前期研究基礎上,選取6個蘋果CYS基因,分析其在低氮脅迫下的表達發(fā)現(xiàn),這6個基因均受低氮脅迫的誘導,表達量上調(diào)顯著。初步確認選取的6個蘋果CYS基因(Md CYS1、Md CYS8、Md CYS15、Md CYS20、Md CYS21、Md CYS26)均參與了M26低氮響應過程。2、組培法研究MpCYS4基因響應低氮脅迫的結果表明:極低氮處理和無氮處理,轉基因植株生長勢優(yōu)于野生型。并且,轉基因植株的根系的根的數(shù)目、長度、表面積等方面明顯大于野生型。初步表明MpCYS4基因的過量表達增強了M26對氮脅迫的抗性。3、沙培法研究MpCYS4基因響應低氮脅迫的結果表明:低氮條件下,M26轉基因植株的根部和地上部的生物量、光合色素含量和凈光合速率明顯大于野生型,但是根冠比小于野生型。同時,MpCYS4基因的過量表達,導致低氮脅迫下葉片的氣孔導度下降,葉片中H2O2積累量顯著降低,而且成熟葉片中全氮含量大于野生型。4、水培法研究MpCYS4基因響應低氮脅迫的結果表明:低氮條件下,M26轉基因植株的根部和地上部的生物量、光合色素含量明顯大于野生型。M26轉基因植株中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性顯著大于野生型,葉片中的H2O2積累量顯著低于野生型植株。M26轉基因植株葉片中硝酸根轉運蛋白基因Md NPF6.8、Md NPF6.9、Md NRT2.4和Md NRT2.7的表達量上調(diào)顯著。綜上所述,通過低氮脅迫下M26的表型與蘋果CYS基因表達,及過表達MpCYS4轉基因M26植株對低氮脅迫的抗性的關聯(lián)分析,初步確定蘋果CYS基因參與了植物的低氮響應。
[Abstract]:CYS, a plant cysteine protease inhibitor, is a family of proteins that can inhibit the activity of cysteine protease in plants. CYS gene has been identified in Arabidopsis, rice, soybean and many other plants.The structural characteristics and biological functions of these genes in different species were revealed.Apple is a nitrate plant, nitrogen stress will seriously affect the growth and development of apple, fruit quality and yield.The function of CYS gene in apple under nitrogen stress has not been reported.In this study, the members of cystatins gene family of apple were identified, MpCYS4 gene (Md CYS21) was cloned from Liriodendron mandshurica, and M26 transgenic plants expressing MpCYS4 gene were obtained.On the basis of this study, the changes of CYS gene expression in apple under low nitrogen stress were systematically analyzed.The resistance of MpCYS4 transgenic plants to low nitrogen stress was studied by tissue culture, sand culture and hydroponics.The results were as follows: 1. The results of low nitrogen stress on apple rootstock M26 showed that the growth of M26 was significantly inhibited by low nitrogen treatment.The dry weight, plant height, stem diameter, chlorophyll content and net photosynthetic rate of M26 in low nitrogen treatment group were significantly lower than those in control group.On the basis of previous study, six apple CYS genes were selected and their expression under low nitrogen stress was analyzed. It was found that all of the six genes were induced by low nitrogen stress and the expression levels were significantly up-regulated.The growth potential of transgenic plants was better than that of wild type.Moreover, the number, length and surface area of roots of transgenic plants were obviously larger than that of wild type.The results showed that the overexpression of MpCYS4 gene enhanced the resistance of M26 to nitrogen stress. The results of MpCYS4 gene response to low nitrogen stress showed that the biomass of root and shoot of M26 transgenic plants under low nitrogen stress was increased.The photosynthetic pigment content and net photosynthetic rate were significantly higher than those of wild type, but the ratio of root to shoot was lower than that of wild type.At the same time, the overexpression of MpCYS4 gene resulted in the decrease of stomatal conductance and H2O2 accumulation in leaves under low nitrogen stress.The total nitrogen content in mature leaves was higher than that in wild type. The results of MpCYS4 gene response to low nitrogen stress showed that: under low nitrogen condition, the biomass of root and shoot of M26 transgenic plants was higher than that of wild type.The content of photosynthetic pigment was significantly higher than that of wild type. M26 transgenic plants. The activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) were significantly higher than those of wild type.The accumulation of H2O2 in leaves was significantly lower than that in wild-type plants. Md NPF6.8 and Md NPF6.9 Md NRT2.4 and Md NRT2.7 were up-regulated significantly.In conclusion, the relationship between the phenotype of M26 under low nitrogen stress and the expression of CYS gene in apple and the resistance to low nitrogen stress of transgenic M26 transgenic plants with overexpression of MpCYS4 was analyzed. It was preliminarily confirmed that the CYS gene of apple was involved in the response to low nitrogen stress in plants.
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S661.1

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本文編號：1720172