本文選題：環(huán)戊酮1　切入點(diǎn)：2-單加氧酶　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：大麗輪枝菌是一種分布廣泛的土傳病原真菌,能夠在660多種植物上引起黃萎病,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。微菌核是大麗輪枝菌特殊的休眠結(jié)構(gòu),可以在土壤中長期存活,是病害的主要初侵染來源。微菌核的萌發(fā)是大麗輪枝菌成功侵染寄主的先決條件,但迄今為止,尚未見微菌核萌發(fā)相關(guān)基因的研究報(bào)道。本研究在前期微菌核萌發(fā)表達(dá)譜的基礎(chǔ)上,選擇上調(diào)倍數(shù)最高的環(huán)戊酮1,2-單加氧酶基因(VDAG_03943),進(jìn)行克隆與功能研究。主要取得了如下結(jié)果:1.基于已公布的大麗輪枝菌Vd Ls.17的基因組序列,克隆得到VDAG_03943序列,該基因全長1929bp,c DNA序列全長1668bp,編碼555個(gè)氨基酸組成的蛋白,命名為Vd CPMO。利用一步法的載體構(gòu)建方法成功得到了Vd CPMO的敲除質(zhì)粒p OSCAR-CPMO。2.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,從野生型菌株JY中敲除了Vd CPMO,經(jīng)過50mg/L的潮霉素抗性篩選,得到了26株候選的敲除轉(zhuǎn)化子菌株。分別使用潮霉素基因檢測(cè)引物Hyg-F和Hyg-R、目的基因檢測(cè)引物CPMO-F和CPMO-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證,確認(rèn)得到了敲除突變體菌株ΔCPMO-1和ΔCPMO-2。利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行功能互補(bǔ)后,得到了14株互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子菌株,經(jīng)過G418抗性篩選、表型測(cè)定和PCR擴(kuò)增檢測(cè)后,確認(rèn)得到3株互補(bǔ)突變體菌株,將其中1株互補(bǔ)突變體菌株并命名為ΔCPMO-C進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。3.敲除突變體菌株ΔCPMO-1、ΔCPMO-2,互補(bǔ)突變體菌株ΔCPMO-C和野生型菌株JY的菌落生長情況、微菌核萌發(fā)率、芽管平均長度的測(cè)定結(jié)果表明,敲除突變體菌株ΔCPMO-1和ΔCPMO-2的菌落生長減慢,微菌核萌發(fā)率顯著降低,芽管平均長度明顯較短,而互補(bǔ)突變體菌株ΔCPMO-C與野生型菌株JY間無顯著性差異;對(duì)棉花和煙草植株致病力測(cè)定結(jié)果表明,敲除突變體菌株ΔCPMO-1和ΔCPMO-2的微菌核喪失了對(duì)棉花的致病力,同時(shí)對(duì)煙草的致病力有所下降,而互補(bǔ)突變體菌株ΔCPMO-C和野生型菌株JY間的致病力無差異。
[Abstract]:Verticillium dahliensis is a widely distributed soil-borne pathogenic fungus, which can cause verticillium wilt in 660 species of plants and cause huge economic losses.Microsclerotia is a special dormant structure of Rhizoctonia dahliensis, which can survive in soil for a long time, and is the main primary infection source of the disease.The germination of microsclerotia is a prerequisite for the successful infection of Rhizoctonia dahliensis, but up to now, no studies on the genes related to microsclerotia germination have been reported.Based on the expression profile of microsclerotia germination in the early stage, the VDAG03943 gene of cyclopentanone 1 + 2-monooxygenase gene was selected to study the cloning and function of cyclopentanone 1 + 2 -monooxygenase gene (VDAG03943).The main results are as follows: 1.Based on the published genome sequence of Vd Ls.17, the VDAG_03943 sequence was cloned. The total length of the gene was 1668 BP, encoding 555 amino acids, which was named Vd CPMO.The whole length of the gene was 1 929 BP, and the total length of the gene was 1668 BP.The knockout plasmid pOSCAR-CPMO.2of VD CPMO was successfully obtained by one-step vector construction method.By means of Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation, 26 candidate knockout transformants were obtained from wild-type strain JY by screening for hygromycin resistance of 50mg/L.Hygromycin gene detection primer Hyg-F and Hyg-Rand objective gene detection primer CPMO-F and CPMO-R were used for PCR validation. The knockout mutants 螖 CPMO-1 and 螖 CPMO-2 were identified.After functional complementation by PEG mediated protoplast transformation, 14 complementary transformants were obtained. After G418 resistance screening, phenotype determination and PCR amplification, 3 complementary mutants were identified.One of the complementary mutants was named 螖 CPMO-C for follow-up test. 3.The colony growth of mutant 螖 CPMO-1, 螖 CPMO-2, complementary mutants 螖 CPMO-C and wild-type strain JY, the germinating rate of microsclerotia and the average length of bud tube were measured. The results showed that the colony growth of 螖 CPMO-1 and 螖 CPMO-2 decreased.The germinating rate of microsclerotia decreased significantly, the average length of bud tube was significantly shorter, but there was no significant difference between the complementary mutants 螖 CPMO-C and wild type strain JY, and the pathogenicity of cotton and tobacco plants was determined.The microsclerotia of the knockout mutants 螖 CPMO-1 and 螖 CPMO-2 lost their pathogenicity to cotton and decreased their pathogenicity to tobacco, but the pathogenicity of complementary mutants 螖 CPMO-C and wild-type strain JY was not different.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S432.44

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本文編號(hào)：1713959