本文選題：前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9　切入點：動脈粥樣硬化　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景:動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是許多重要血管事件的病理基礎(chǔ),目前是導(dǎo)致人類各種致死病因的首位。隨著人民生活水平的提高及人口的老齡化,動脈粥樣硬化的發(fā)病率逐年上升,因而對AS的發(fā)病機制及病理過程進行深入探討具有重大的社會效益和經(jīng)濟效益。AS發(fā)病機制十分復(fù)雜,有關(guān)學(xué)說甚多,目前認(rèn)為AS是一種以脂質(zhì)沉積異常為特征的慢性炎癥性疾病。諸多AS危險因素中,氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是促進內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的最主要原因。Ox-LDL可以促進平滑肌細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、增殖和遷移,以及引起內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞損傷,最終導(dǎo)致AS斑塊形成。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是和常染色體顯性高固醇血癥相關(guān)的新型基因,可以降解肝細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體(LDLR),使循環(huán)中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)清除障礙,增加血漿中LDL-C水平,從而參與膽固醇代謝的調(diào)節(jié),促進AS的進展。但是,PCSK9是否可以通過影響內(nèi)皮細(xì)胞功能對AS產(chǎn)生直接的毒性作用,至今沒有突破性進展。替格瑞洛是新型的血小板抑制劑,通過和P2Y12受體結(jié)合,抑制血小板活性,防止冠心病患者發(fā)生血栓事件,但是替格瑞洛是否可以參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能對AS有直接的影響未見報道。目的:本研究擬通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)PCSK9基因,以慢病毒包裝轉(zhuǎn)染入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中,在ox-LDL刺激下測定凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達量,觀察下調(diào)PCSK9對細(xì)胞凋亡的影響,并進行可能的機制探討;將替格瑞洛應(yīng)用于小鼠及HUVEC,觀察其對AS斑塊及內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用。方法:本研究分三部分1、應(yīng)用高脂喂養(yǎng)Apo E基因敲除小鼠構(gòu)建動脈粥樣硬化模型:18只健康雄性4-6周齡小鼠:正常組:野生型C57BL/6J小鼠(8只);模型組:高脂喂養(yǎng)Apo E-/-小鼠(5只);替格瑞洛組:高脂喂養(yǎng)Apo E-/-小鼠,替格瑞洛灌胃10天(5只)。(1)喂養(yǎng)20周,測定血清血脂水平;(2)解剖小鼠,分離主動脈,進行病理學(xué)切片,行HE染色,觀察血管形態(tài);免疫組織化學(xué)測定斑塊內(nèi)PCSK9表達情況;masson染色,觀察血管斑塊形態(tài)。2、體外培養(yǎng)HUVEC。(1)ox-LDL以不同濃度、不同時間刺激HUVEC,觀察PCSK9、Bax、caspase3、Bcl-2表達情況;應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況;(2)設(shè)計合成兩對針對PCSK9的是sh RNA,以慢病毒為載體轉(zhuǎn)染入HUVEC,細(xì)胞分為三組:279-vector(control group)、sh RNA-PCSK9-1 group以及sh RNA-PCSK9-2 group。三組細(xì)胞在ox-LDL 50μg/ml刺激24h,檢測PCSK9表達水平,計算抑制效率;檢測PCSK9、Bax、caspase3、Bcl-2以及MAPK通路相關(guān)蛋白表達情況;流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率;(3)細(xì)胞劃痕實驗:測定sh RNA-PCSK9對細(xì)胞遷移能力的影響;(4)細(xì)胞黏附實驗:檢測sh RNA-PCSK9對內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)黏附作用的影響。3、替格瑞洛體外實驗。將替格瑞洛添加到內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中,以ox-LDL 50μg/ml刺激24h。(1)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率;(2)檢測替格瑞洛對PCSK9、Bax、caspase3、Bcl-2以及MAPK通路相關(guān)蛋白m RNA和蛋白表達水平的影響;(3)觀察替格瑞洛對細(xì)胞黏附作用的影響。結(jié)果:1、構(gòu)建動脈粥樣硬化模型。(1)高脂喂養(yǎng)Apo E基因敲除小鼠20周,成功建立動脈粥樣硬化模型;(2)高脂喂養(yǎng)后血脂水平明顯升高,但替格瑞洛組較模型組血脂水平無明顯差異(P0.05);(3)HE結(jié)果顯示,正常組主動脈內(nèi)膜光滑完整,模型組主動脈內(nèi)有明顯的斑塊形成,替格瑞洛組斑塊面積減小,病變進展緩慢;免疫組化結(jié)果提示動脈粥樣斑塊內(nèi)PCSK9表達量高,替格瑞洛使PCSK9表達減少。2、體外培養(yǎng)HUVEC。(1)ox-LDL 50μg/ml和100μg/ml刺激HUVEC發(fā)生凋亡,24h細(xì)胞凋亡達到峰值,兩濃度之間無差異;轉(zhuǎn)染sh RNA-PCSK9細(xì)胞凋亡率下降;(2)50μg/ml ox-LDL刺激HUVEC,激活PCSK9、Bax、caspase3,下調(diào)Bcl-2,呈時間依賴性(P0.05);(3)RT-PCR和western blot結(jié)果提示sh RNA-PCSK9使細(xì)胞內(nèi)PCSK9、Bax、caspase3、p-p38、p-JNK表達下降(P0.05),Bcl-2表達升高(P0.05);(4)sh RNA-PCSK9對細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附無明顯影響。3、體外培養(yǎng)HUVEC。(1)ox-LDL刺激下,替格瑞洛使細(xì)胞凋亡率下降;(2)RT-PCR和western blot結(jié)果提示替格瑞洛使細(xì)胞內(nèi)PCSK9、Bax、caspase3、p38/p-p38、JNK/p-JNK、ERK/p-ERK表達下降(P0.05),Bcl-2表達升高(P0.05);(3)替格瑞洛作用下和細(xì)胞外基質(zhì)黏附的內(nèi)皮細(xì)胞增多。結(jié)論:1、高脂喂養(yǎng)Apo E基因敲除小鼠20周可以成功建立動脈粥樣硬化模型;PCSK9在斑塊內(nèi)表達升高;替格瑞洛可減少斑塊內(nèi)PCSK9表達,并減輕斑塊病變,其穩(wěn)定斑塊的作用獨立于降脂效應(yīng)。2、ox-LDL刺激HUVEC可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,sh RNA-PCSK9可以通過抑制p-p38和p-JNK信號通路減弱下游Bax、caspase3活性、增強Bcl-2活性而抑制細(xì)胞凋亡;下調(diào)PCSK9對細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移無明顯影響。3、替格瑞洛可以通過下調(diào)Bax、caspase3、上調(diào)Bcl-2表達水平抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡,并且可能是通過抑制MAPK相關(guān)蛋白p38/p-p38、JNK/p-JNK、ERK/p-ERK實現(xiàn)的;替格瑞洛可以促進內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附;替格瑞洛可以下調(diào)HUVEC中PCSK9的表達水平。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5

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