本文選題：TCR　切入點(diǎn)：CRISPR-Cas9　出處：《廣東藥科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:針對(duì)TCRαC區(qū)設(shè)計(jì)出三個(gè)CRISPR靶向編輯位點(diǎn),對(duì)這三個(gè)編輯位點(diǎn)進(jìn)行篩選,找出編輯效果較好的質(zhì)粒并對(duì)其脫靶率進(jìn)行評(píng)估�？疾霤RISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)人源的不同類型的細(xì)胞系的基因編輯情況,并初步探尋人源不同類型細(xì)胞的基因修復(fù)機(jī)制。針對(duì)CRISPR-Cas9-TRAC系統(tǒng)構(gòu)建相應(yīng)的腺病毒載體,為后續(xù)對(duì)于人源T細(xì)胞TCR基因的編輯奠定基礎(chǔ)。方法:一、CRISPR-Cas9-TRAC系統(tǒng)的構(gòu)建及功能、脫靶率的評(píng)估利用CRISPR網(wǎng)站(http://crispr.mit.edu/)提供的靶向編輯位點(diǎn)篩選工具,針對(duì)TCRαC區(qū)設(shè)計(jì)出3個(gè)基因編輯位點(diǎn),并構(gòu)建CRISPR-Cas9-TCR系統(tǒng),通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞系中,利用流式細(xì)胞術(shù)法和PCR結(jié)合T-A克隆測(cè)序等方法篩選出編輯效果較好的質(zhì)粒并驗(yàn)證其編輯效率。然后,利用脫靶在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://crispr.mit.edu/;https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/index.php;http://cas9.cbi.pku.edu.cn/;http://gt-scan.braembl.org.au/gt-scan/submit),預(yù)測(cè)其潛在的脫靶位點(diǎn),綜合選取分值較高的10個(gè)潛在脫靶位點(diǎn),分別設(shè)計(jì)出相應(yīng)的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序,檢測(cè)其是否存在脫靶現(xiàn)象。二、CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)不同細(xì)胞系基因編輯情況的對(duì)比為進(jìn)一步分析不同細(xì)胞的基因修復(fù)系統(tǒng)是否存在差異,將篩選出的具有較好編輯效率的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入不同類型的人源細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞),檢測(cè)其對(duì)不同細(xì)胞的基因組編輯情況。同時(shí)對(duì)參與NHEJ修復(fù)的基因(Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Ligase4、XRCC4、XLF、APTX、PNKP、APLF、Td P1、Td P2、Artemis、Metnase、WRN、Mre11、poll、polm、TDT)進(jìn)行表達(dá)分析,對(duì)這些修復(fù)基因在人源不同類型細(xì)胞的表達(dá)中是否存在差異性進(jìn)行初步的考察。三、CRISPR-Cas9系統(tǒng)的腺病毒載體構(gòu)建及條件優(yōu)化為了以后進(jìn)一步探究CRISPR-Cas9-TCR系統(tǒng)對(duì)于T細(xì)胞的基因編輯情況,基于以往工作基礎(chǔ),首先需要將CRISPR-Cas9-TCR系統(tǒng)進(jìn)行腺病毒載體的構(gòu)建,以利用腺病毒作為載體將CRISPR-Cas9-TCR系統(tǒng)轉(zhuǎn)入T細(xì)胞內(nèi)。將p X330的U6+g RNA區(qū)段和Cas9基因區(qū)段分別連入p DC315載體構(gòu)建穿梭質(zhì)粒,以便將來分別進(jìn)行重組腺病毒的包裝。其中,U6+g RNA是通過PCR擴(kuò)增的方法得到,同時(shí)在兩端引入Eco RI和Xba I的酶切位點(diǎn),將擴(kuò)增得到的目的片段與T載體連接構(gòu)建出過渡質(zhì)粒,再通過對(duì)p DC315和過渡質(zhì)粒的酶切(Eco RI、Xba I)、連接的系列反應(yīng)構(gòu)建得到p DC315-U6+g RNA腺病毒穿梭質(zhì)粒;在構(gòu)建p DC315-Cas9的過程中,通過對(duì)p DC315質(zhì)粒的系列改造,在其多克隆位點(diǎn)添加Age I酶切位點(diǎn),進(jìn)而達(dá)到能夠與Cas9片段進(jìn)行粘末端連接的目的。將改造后的p DC315和p X330分別進(jìn)行一系列酶切(Age I、Eco RI、Xba I)、連接等反應(yīng)構(gòu)建出p DC315-Cas9腺病毒穿梭質(zhì)粒。結(jié)果:一:CRIPSPR-Cas9-TRAC質(zhì)粒構(gòu)建成功,并完成功能驗(yàn)證及脫靶率檢測(cè)基于p X458質(zhì)粒,將針對(duì)TRAC設(shè)計(jì)的三個(gè)靶位點(diǎn)分別構(gòu)建出敲除質(zhì)粒(p X458-site1、p X458-site2、p X458-site3),將這三種質(zhì)粒利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法分別導(dǎo)入293T細(xì)胞系,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)這三種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率:p X458-site1為38.4%,p X458-site2為30.5%,p X458-site3為37.8%。轉(zhuǎn)染72h后對(duì)這三組細(xì)胞分別提取基因組DNA,通過PCR擴(kuò)增以及PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序,可知p X458-site2質(zhì)粒發(fā)生了有效編輯,通過T-A克隆和單克隆測(cè)序分析可知,在35個(gè)單克隆中有8個(gè)發(fā)生了基因編輯,綜合考慮轉(zhuǎn)染效率,其基因編輯效率為74.7%。針對(duì)10個(gè)易脫靶位點(diǎn)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的測(cè)序,結(jié)果表明這10個(gè)位點(diǎn)均未發(fā)生基因編輯現(xiàn)象,可知p X458-site2具有較好的靶向性。二、CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)于不同細(xì)胞系的編輯情況存在差異將p X458-site2分別轉(zhuǎn)入HEK-293、Hela、SW480細(xì)胞系,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率如下:HEK-293為29.4%,Hela為17.7%,SW480為21.9%。轉(zhuǎn)染72h后提取各組細(xì)胞的基因組DNA,通過PCR擴(kuò)增、T-A克隆、測(cè)序等系列實(shí)驗(yàn)可知:293細(xì)胞系的25個(gè)克隆中有5個(gè)發(fā)生了基因編輯,其中4個(gè)發(fā)生了A/T插入,且插入位點(diǎn)均位于PAM位點(diǎn)上游的第三個(gè)堿基處,編輯效率為68%;Hela細(xì)胞系的45個(gè)克隆中有1個(gè)發(fā)生了編輯,編輯情況為A/T堿基的插入,編輯效率為13.47%;SW480細(xì)胞系的56個(gè)克隆有4個(gè)發(fā)生了基因編輯,其中有兩個(gè)發(fā)生了A/T插入,且插入位點(diǎn)均位于PAM位點(diǎn)上游的第三個(gè)堿基處,基因編輯效率為32.7%。利用Pubmed網(wǎng)站下載參與NHEJ修復(fù)的基因(Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Ligase4、XRCC4、XLF、APTX、PNKP、APLF、Td P1、Td P2、Artemis、Metnase、WRN、Mre11、poll、polm、TDT),并設(shè)計(jì)出相應(yīng)的上下游引物,通過PCR擴(kuò)增后,對(duì)這些基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,結(jié)果表明這些基因在不同細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)確實(shí)存在差異性,為后續(xù)的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。三、CRISPR-Cas9系統(tǒng)的兩個(gè)腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功成功構(gòu)建出p DC315-U6+g RNA和p DC315-Cas9腺病毒穿梭質(zhì)粒。結(jié)論:成功構(gòu)建出了TRAC敲除質(zhì)粒,并證明p X458-site2具有較好的編輯效率,且通過檢測(cè)可知其脫靶率很低;在CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)不同類型人源細(xì)胞的基因編輯情況中,發(fā)現(xiàn)編輯效率和編輯結(jié)果有所差異,分析原因可能與參與NHEJ過程的基因表達(dá)差異有關(guān),并對(duì)該推論進(jìn)行了初步的驗(yàn)證,證明了差異性的存在,該結(jié)果為今后不同細(xì)胞內(nèi)NHEJ修復(fù)機(jī)制的差異研究奠定了基礎(chǔ);此外還成功構(gòu)建了CRISPR-Cas9系統(tǒng)重組腺病毒載體(p DC315-U6-g RNA、p DC315-Cas9),為后續(xù)針對(duì)T細(xì)胞的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of CRISPR - Cas9 - TRAC system on the gene editing of human T cell TCR gene and to establish the gene repair mechanism of CRISPR - Cas9 - TRAC system . In the process of constructing pDC315 - Cas9 , we constructed pDC315 - Cas9 - TCR system to construct pDC315 - Cas9 - TCR system . The transfection efficiency of pX458 - site2 was analyzed by PCR amplification , T - A cloning and sequencing . The expression of these genes in different types of human source cells was analyzed by PCR amplification . The results showed that there was a difference in the expression of these genes in different types of human source cells .

【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R450;R730.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1690519