本文選題：CHIR99021　切入點(diǎn)：Wnt　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：表觀遺傳是在不改變DNA的序列的情況下對DNA或染色體的修飾。DNA甲基化是主要的表觀遺傳修飾,具有重要的調(diào)控功能。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)能夠催化甲基從S腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到DNA。哺乳動(dòng)物中的DNMT家族有五個(gè)成員:DNMT1,DNMT2,DNMT3A,DNMT3B,DNMT3L,其中DNMT3L因缺少催化結(jié)構(gòu)域而不具有任何催化活性,但會(huì)與DNMT3A和DNMT3B相互作用促進(jìn)它們的活性。Wnt信號通路是胚胎發(fā)育過程中重要的組成,其中經(jīng)典Wnt通路依賴β-catenin轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中,通過與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子(T-cell factor/lymphoid enhancer-binding factor,TCF/LEF)結(jié)合,激活或抑制下游基因的表達(dá)。CHIR99021與PD0325901能夠起到抑制細(xì)胞分化的作用,其中CHIR99021是常用的GSK3β的抑制劑,通過抑制此酶活性,使β-catenin在核內(nèi)積累,達(dá)到Wnt后續(xù)的轉(zhuǎn)錄信號傳遞。本文首先利用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn),確定了不同濃度CHIR99021對甲基轉(zhuǎn)移酶家族基因的表達(dá)影響,發(fā)現(xiàn)對Dnmt3l基因有明顯下調(diào)作用,而對于Dnmt3a,Dnmt3b等其余家族基因沒有明顯作用。利用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)確定了針對小鼠F9細(xì)胞,最適的CHIR99021處理濃度為10μM,并以此為重點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究,確定CHIR99021下調(diào)基因的具體機(jī)制。通過構(gòu)建pCMV-Myc-β-catenin、pCDNA3.1-β-catenin和pCDNA3.1-β-catenin S37A載體,利用核質(zhì)蛋白分離提取實(shí)驗(yàn)以及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CHIR99021對F9細(xì)胞處理后,β-catenin蛋白的總表達(dá)量有明顯提高,并且細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin含量都比對照組高,說明,CHIR99021可以通過抑制GSK3β來增加細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的穩(wěn)定性,并且入核量也隨之增高。通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明CHIR99021會(huì)對Wnt/β-catenin經(jīng)典通路造成影響,激活該通路。過表達(dá)β-catenin后,Dnmt3l基因的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào),因此可得,在小鼠F9細(xì)胞中CHIR99021能夠通過抑制GSK3β,使β-catenin在細(xì)胞核中積累,激活Wnt/β-catenin經(jīng)典通路,最終導(dǎo)致Dnmt3l基因的抑制。β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后,通常會(huì)與TCF/LEF復(fù)合體共同作用,并激活基因的轉(zhuǎn)錄,而對于本文研究基因Dnmt3l的抑制效果很少見。此復(fù)合體中起到抑制效果的只有TCF3蛋白,其余成員起轉(zhuǎn)錄激活效果,而近期研究對TCF3的抑制機(jī)制并不明確,而且對其在經(jīng)典Wnt通路的作用沒有準(zhǔn)確和唯一的答案,因此,我對TCF3在此機(jī)制中的作用進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾,免疫熒光染色,實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn),確定下調(diào)Tcf3(Tcf7l1)基因的表達(dá)會(huì)對Dnmt3l基因有上調(diào)的影響,并且Tcf3和β-catenin基因在經(jīng)過CHIR99021處理24h后,都具有上調(diào)效果。綜上,本研究證明了CHIR99021能夠通過抑制GSK3β,使β-catenin在細(xì)胞核中積累,激活Wnt/β-catenin經(jīng)典通路,β-catenin與核內(nèi)的TCF3結(jié)合,共同抑制Dnmt3l基因的表達(dá),為CHIR99021促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的自我更新能力提供理論依據(jù)。
[Abstract]:Epigenetics is the modification of DNA or chromosomes without changing the sequence of DNA. DNA methylation is the main epigenetic modification. DNMTs have an important regulatory function. DNMTs can catalyze the transfer of methyl from S-adenosylmethionine to DNA.The DNMT family in mammals has five members: DNMT1, DNMT2DNMT3AnMT3An, DNMT3ANMT3DNMT3L, in which DNMT3L does not have any catalytic activity due to its lack of catalytic domain. However, the interaction with DNMT3A and DNMT3B promotes their activity. Wnt signaling pathway is an important component of embryonic development, in which the classical Wnt pathway depends on 尾 -catenin translocation into the nucleus. By binding to T-cell factor/lymphoid enhancer-binding factor-T cell factor/lymphoid enhancer-binding factor-T cell / lymphoid enhancement binding factor TCF / LEF, activation or inhibition of downstream gene expression. CHIR99021 and PD0325901 can inhibit cell differentiation. CHIR99021 is a commonly used inhibitor of GSK3 尾, by inhibiting the activity of this enzyme. 尾 -catenin was accumulated in the nucleus to achieve the subsequent transcriptional signal transduction of Wnt. Firstly, the effects of different concentrations of CHIR99021 on the expression of methyltransferase family genes were determined by real-time quantitative PCR assay, and it was found that the effect of 尾 -catenin on the expression of Dnmt3l gene was down-regulated. However, there was no obvious effect on other family genes, such as Dnmt3ah3b and Dnmt3b. The optimal concentration of CHIR99021 for mouse F9 cells was determined by Western blotting assay, and the following study was carried out with emphasis on the treatment of Dnmt3aH, Dnmt3b and Dnmt3b. By constructing pCMV-Myc- 尾 -catenin pCDNA3.1- 尾 -catenin and pCDNA3.1- 尾 -catenin S37A vectors, we found that the total expression of 尾 -catenin protein was significantly increased after treated with CHIR99021 on F9 cells. The content of 尾 -catenin in cytoplasm and nucleus was higher than that in control group, indicating that CHIR99021 could increase the stability of 尾 -catenin by inhibiting GSK3 尾. The results of double luciferase report showed that CHIR99021 could affect the classical Wnt/ 尾 -catenin pathway and activate the pathway. After overexpression of 尾 -catenin, the expression of Dnmt3l gene was down-regulated, so the expression of Dnmt3l gene was down-regulated, and the expression of Dnmt3l gene was down-regulated after overexpression of 尾 -catenin. In mouse F9 cells, CHIR99021 can inhibit GSK3 尾, make 尾 -catenin accumulate in the nucleus, activate the classical pathway of Wnt/ 尾 -catenin, and eventually lead to the inhibition of Dnmt3l gene. 尾 -catenin usually works with TCF/LEF complex and activates gene transcription. However, the inhibitory effect of the gene Dnmt3l is rare. Only the TCF3 protein plays an inhibitory role in this complex, while the other members have transcriptional activation effect, but the mechanism of inhibition of TCF3 in recent studies is not clear. There is no accurate and unique answer to the role of TCF3 in the classical Wnt pathway. Therefore, I have studied the role of TCF3 in this mechanism. In this study, RNA interference, immunofluorescence staining, real-time quantitative PCR and Western blotting were used. It was determined that down-regulating the expression of Tcf3, Tcf7l1) gene would affect the up-regulation of Dnmt3l gene, and that both Tcf3 and 尾 -catenin genes could be upregulated after 24 hours of CHIR99021 treatment. In conclusion, this study demonstrated that CHIR99021 can make 尾 -catenin accumulate in the nucleus by inhibiting GSK3 尾. Activation of the classical Wnt/ 尾 -catenin pathway, 尾 -catenin binding to TCF3 in the nucleus, inhibition of the expression of Dnmt3l gene, which provides a theoretical basis for CHIR99021 to promote the self-renewal ability of embryonic stem cells.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：1690178