本文選題：家蠶　切入點(diǎn)：N-乙酰轉(zhuǎn)移酶　出處：《浙江理工大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：N-乙�；D(zhuǎn)移酶(N-acetyltransferase,NAT,EC 2.3.1.5)是一種催化乙�；鶊F(tuán)在乙酰輔酶A和胺之間轉(zhuǎn)移的酶。昆蟲NAT主要與色素沉積、生理節(jié)律、幾丁質(zhì)的合成、殺蟲藥物的設(shè)計(jì)等有關(guān)。家蠶(Bombyx mori)是繼果蠅之后又一典型的鱗翅目模式生物,還能作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)一些重要的藥用重組蛋白。目前對(duì)家蠶N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Bombyx mori NAT,BmNAT)的研究還比較少,關(guān)于BmNAT基因在家蠶中的基因調(diào)控機(jī)制還沒(méi)有相關(guān)報(bào)導(dǎo)。我們根據(jù)已公布的家蠶N-乙�；D(zhuǎn)移酶基因(Bombyx mori NAT,BmNAT)序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,該基因序列全長(zhǎng)1690 bp,ORF為1065 bp,編碼355個(gè)氨基酸殘基,分子量大小為39.894kDa(GenBank登錄號(hào):XP_004932777.1),等電點(diǎn)pI為5.609;多序列比對(duì)的同源性分析表明,BmNAT與同是家蠶微管組織的其他BmNAT蛋白同源性較高,而與其他昆蟲或者高等動(dòng)物的NAT同源性較低,與BmNAT(GenBank登錄號(hào):XP_004932776.1)的同源性最高;與玉帶鳳蝶(Papilio polytes)同源蛋白同源性最低。通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-BmNAT,在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,經(jīng)SDS-PAGE分析,在43 kDa左右有一條特異性蛋白條帶,與預(yù)期大小(融合標(biāo)簽3.56 kDa,BmNAT 39.894 kDa)相符。經(jīng)純化蛋白并免疫新西蘭兔制備多克隆抗體,間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)達(dá)到1:12800以上,Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗體特異性較高。分別提取家蠶各發(fā)育時(shí)期和五齡幼蟲各組織的總RNA和總蛋白,qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)BmNAT在家蠶各時(shí)期和各組織的表達(dá)情況,分析BmNAT的表達(dá)譜。結(jié)果表明,BmNAT在家蠶頭部、蛾期、卵期的表達(dá)量較高,初步推斷BmNAT可能在這些組織或時(shí)期中發(fā)揮一定的功能。亞細(xì)胞定位顯示BmNAT主要存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。通過(guò)構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pIEx-1-BmNAT,轉(zhuǎn)染進(jìn)入BmN細(xì)胞,過(guò)表達(dá)BmNAT蛋白,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示BmNAT對(duì)細(xì)胞周期可能存在一定的影響。前期研究表明,BmNAT存在乙�；揎�,我們通過(guò)定點(diǎn)突變、免疫沉淀和Western blotting檢測(cè),進(jìn)一步證實(shí)了BmNAT的乙�；捌湫揎椢稽c(diǎn)。本研究首次證實(shí)家蠶乙�；副旧淼囊阴；揎�,為認(rèn)識(shí)家蠶新的基因翻譯后修飾調(diào)控機(jī)理打下基礎(chǔ)。
[Abstract]:N-acetyltransferase (N-acetyltransferase) is an enzyme that catalyzes the transfer of acetyl groups between acetyl coenzyme A and amine. Insect NAT is mainly associated with pigment deposition, physiological rhythm, and chitin synthesis. Bombyx morii (Bombyx morii) is another typical Lepidoptera model organism after Drosophila. It can also be used as a bioreactor to produce some important pharmaceutical recombinant proteins. At present, studies on the silkworm N-acetyltransferase gene, Bombyx mori nat, BmNATs, are relatively rare. There is no related report on the gene regulation mechanism of BmNAT gene in silkworm. We have carried out bioinformatics analysis based on the published sequence of silkworm N-acetyltransferase gene Bombyx mori nat. The total length of the gene is 1065 BP, encoding 355 amino acid residues, the molecular weight is 39.894kDa(GenBank accession number 0: XP 003 2777.1, and the isoelectric point Pi is 5. 609. The homology analysis of multiple sequence alignment shows that BmNat has high homology with other BmNAT proteins in the same microtubule of Bombyx mori. The homology of NAT with other insects or higher animals was lower, and the homology with BmNAT(GenBank accession number XP0049327761 was the highest, and the homology with Papilio polytes was the lowest. The fusion protein was expressed in Escherichia coli by constructing the prokaryotic expression plasmid pET28a-BmNAT. After the recombinant plasmid was transformed into BL21DE-3 SDS-PAGE, there was a specific protein band about 43 kDa, which was consistent with the expected size (fusion label 3.56 kDa BmNat 39.894 kDa). The purified protein was then immunized to prepare polyclonal antibodies from New Zealand rabbits. Indirect ELISA assay showed that the antibody titer was more than 1: 12800 and the specificity of the antibody was higher. Total RNA and total protein were extracted from the tissues of silkworm and fifth instar larva respectively. The expression of BmNAT was detected by RT-PCR and Western blotting in all stages and tissues of Bombyx mori. The expression of BmNAT was analyzed. The results showed that the expression of BmNat was higher in the head, moth and egg stage of Bombyx mori. The subcellular localization showed that BmNAT mainly existed in cytoplasm and nucleus. The recombinant eukaryotic expression vector pIEx-1-BmNATA was transfected into BmN cells and overexpression of BmNAT protein. The results of flow cytometry showed that BmNAT might have an effect on cell cycle. Previous studies have shown that there is acetylation of BmNat. We detected it by site-directed mutagenesis, immunoprecipitation and Western blotting. The acetylation of BmNAT and its modification site were confirmed for the first time in this study, which laid a foundation for the understanding of the regulation mechanism of the new gene post-translational modification in silkworm, Bombyx mori (Bombyx mori).
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1672810