發(fā)布時(shí)間：2018-03-26 17:34

  本文選題：家蠶　切入點(diǎn)：Bmtol基因　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：家蠶是一種鱗翅目昆蟲(chóng)的模式生物,又是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng),在我國(guó)擁有相當(dāng)長(zhǎng)的馴養(yǎng)歷史。同時(shí),家蠶又屬于變態(tài)發(fā)育昆蟲(chóng),在整個(gè)生活發(fā)育史中要經(jīng)歷卵、幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)4個(gè)階段,從幼蟲(chóng)到成蟲(chóng)的生長(zhǎng)、發(fā)育等過(guò)程主要受到保幼激素(Juvenile hormone,JH)和蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)的調(diào)控。而保幼激素結(jié)合蛋白(juvenile hormone binding protein,JHBP)是JH在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和發(fā)揮功能的載體,是Takeout/JHBP蛋白家族的一個(gè)總稱(chēng)。該家族蛋白都含有一個(gè)保守的JHBP結(jié)構(gòu)域,同時(shí)在N端有兩個(gè)Cys殘基形成一個(gè)二硫鍵,連接于N末端和α1螺旋的第一個(gè)彎曲,被認(rèn)為是該家族蛋白結(jié)合配體的核心部位。對(duì)于JHBP的研究,有利于進(jìn)一步闡明家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理,也有利于蠶絲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。takeout(to)基因最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn),隨后在其他昆蟲(chóng)中也發(fā)現(xiàn)了to基因的同源基因,而且該基因家族為昆蟲(chóng)特有。在家蠶中已鑒定出了幾種to基因,發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)與其他昆蟲(chóng)的同源基因相類(lèi)似,但目前對(duì)其功能的研究很少。在本研究中,我們通過(guò)SilkDB和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出一個(gè)新的takeout like(tol)基因,并應(yīng)用生物信息學(xué)分析、基因克隆、原核表達(dá)、Western Blot、激素處理等方法對(duì)家蠶體內(nèi)Bmtol基因進(jìn)行鑒定,并對(duì)其在家蠶體內(nèi)的表達(dá)和功能進(jìn)行探究,為深入研究JHBP在家蠶體生長(zhǎng)、生殖、變態(tài)等發(fā)育中的作用提供理論支持。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)家蠶Bmtol基因的克隆和生物信息學(xué)分析以家蠶大造品種5齡3天頭部cDNA為模板,利用PCR擴(kuò)增成功克隆出家蠶Bmtol基因。對(duì)家蠶Bmtol基因的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,該基因的開(kāi)放閱讀框ORF為759 bp,包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子,編碼的氨基酸序列為252個(gè)氨基酸,其蛋白理論分子量為27.72 KD,等電點(diǎn)為6.16。該蛋白含有一段23個(gè)氨基酸序列的信號(hào)肽,并對(duì)其進(jìn)行了細(xì)胞定位預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)該蛋白可能是分泌蛋白,親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白為親水性蛋白。(2)家蠶Bmtol基因的原核表達(dá)、蛋白純化及抗體制備由于家蠶Bmtol基因編碼的蛋白序列在N端含有一段信號(hào)肽,為了能夠成功表達(dá)出該蛋白,故選擇非信號(hào)肽的區(qū)域進(jìn)行原核表達(dá)載體的構(gòu)建,表達(dá)載體為pET28(a),表達(dá)菌為E.coli BL21(DE3)。對(duì)重組工程菌蛋白表達(dá)條件及可溶性進(jìn)行分析,最后確定28℃、IPTG濃度0.6 mM、誘導(dǎo)時(shí)間8 h為原核表達(dá)的最佳條件進(jìn)行重組蛋白的大量表達(dá)。并對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行Ni-NTA親和層析,成功純化出重組蛋白,對(duì)重組蛋白進(jìn)行透析、濃縮得到純度和含量都較高的重組蛋白。對(duì)濃縮后的重組蛋白制備多克隆抗體,并對(duì)抗體進(jìn)行ELISA效價(jià)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)抗體效價(jià)大于512,000,同時(shí)對(duì)抗體進(jìn)行了特異性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。(3)家蠶Bmtol基因的表達(dá)特征分析和功能初探應(yīng)用RT-PCR和qPCR技術(shù)分析Bmtol基因在家蠶組織的表達(dá)特征,發(fā)現(xiàn)該基因主要在家蠶的的頭部有較高的表達(dá)量,其次在表皮和精巢也有表達(dá),而在其它組織中表達(dá)量很低或沒(méi)有,這可能與家蠶個(gè)體發(fā)育和生殖發(fā)育的調(diào)控有關(guān),主要作用機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)Bmtol主要在每個(gè)齡期的起蠶時(shí)表達(dá)量較高,從5齡3天到化蛹7天Bmtol基因的表達(dá)量較低,到化蛾后其表達(dá)量又開(kāi)始上調(diào),說(shuō)明Bmtol基因除了參與幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控外,還可能參與化蛾后其它調(diào)控。利用Western Blot技術(shù)對(duì)BmTOL蛋白在家蠶各組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)結(jié)果與在核酸水平上的檢測(cè)結(jié)果基本類(lèi)似�；谇捌趯�(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)家蠶進(jìn)行激素處理,研究Bmtol基因在頭部的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異不是很明顯,而且隨處理后時(shí)間的變化也沒(méi)有太大的差異�？赡芘c這個(gè)基因在5齡后期較低的表達(dá)有一定的關(guān)系。同時(shí),又對(duì)處理的家蠶頭部組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn),對(duì)其在頭部組織進(jìn)行定位和定性分析,結(jié)果也沒(méi)有太明顯的變化。
[Abstract]:In this study , we have identified several to genes in silkworm . The expression of recombinant protein was determined by means of reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) .

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;S881.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1668856