本文選題：煙草　切入點：煙草花葉病毒　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：作為煙草花葉病毒屬(Tobawovirus)的代表種,煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是煙草中廣泛傳播的一種病毒,嚴重影響煙草的品質(zhì)和產(chǎn)量。因此,篩選高抗TMV的煙草材料,鑒定抗性基因并分析其表達特征具有重要意義。另一方面,在植物抗病毒防衛(wèi)反應的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程中,microRNA(miRNA)起著重要的作用,它可介導具有同源序列的外源病毒基因miRNA裂解或抑制其翻譯。煙草CV58(Vicotiana tabacum cv.CV58)作為一種高抗TMV的重要種質(zhì)資源,對其開展miRNA的鑒定與功能分析,有助于闡釋品種的抗性信號通路。本研究主要研究成果如下:1.抗病性鑒定表明,煙草研究所自主培育煙草品種CV58在感染TMV后3天出現(xiàn)明顯的HR,形成類似N基因的枯斑癥狀,限制病毒擴展,為鑒定此抗性基因,首先通過PCR同源克隆獲得煙草CV58中抗性基因的CDS序列及基因組序列,序列分析顯示含3435 bp核苷酸,編碼1145個氨基酸,序列同源性比較顯示與N基因有99%的相似性。為進一步驗證CV58抗TMV特性由N基因所致,構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除載體,分別獲得靶位點序列缺失2個和3個堿基的純合突變植株,突變煙草植株在接種TMV后顯示失去對TMV的抗性而出現(xiàn)花葉癥狀,且其溫度敏感性一并喪失。再通過農(nóng)桿菌介導的方法將該基因轉(zhuǎn)入感病煙草植株K326中進行過表達,接種TMV后同樣出現(xiàn)類似N基因的枯斑,且具有溫度敏感性。綜上所述,最終確定煙草CV58的抗性來源于N基因。2.CV58植株分別接種TMV或PBS,提取總RNA經(jīng)Illumina Hiseq 2000測序系統(tǒng)檢測miRNA,與己知數(shù)據(jù)庫比對篩選出兩樣本RNA中差異表達的miRNA。將差異表達的miRNA分為上調(diào)組和下調(diào)組,分別對選定的miRNA進行靶基因預測;對交集的靶標基因集合分別進行GO富集分析和KEGG分析,預測可能的信號通路。表達譜分析顯示:在差異表達的己知329個miRNA中,(上調(diào)211個,下調(diào)118個,p0.05),256個具有顯著差異的 miRNA(Fold-change1.00 的有 184 個,Fold-change-1.00 的 72 個)。TMV抗性相關的miRNA差異表達譜信息學分析靶標基因指向植物-病源菌互作、細胞發(fā)育和分裂、抗性基因R介導的吞噬等7條通路,為后續(xù)的驗證miRNA在植物抗病毒機制中的作用提供依據(jù)。3.以TMV侵染煙草CV58的葉片為材料,利用GeNorm和NorFinder程序?qū)Π?個成熟miRNAs和5個傳統(tǒng)的看家基因14個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行評價。結(jié)果顯示在TMV侵染脅迫下,在煙草CV58組織、葉片中,成熟miRNA定量最合適的單個內(nèi)參基因分別為L25、miR159,最合適的內(nèi)參基因組合為L25,Ntubc2。
[Abstract]:As a representative species of the genus Tobawovirus, tobacco mosaic virus (TMV) is a widely spread virus in tobacco, which seriously affects the quality and yield of tobacco. It is important to identify resistance genes and analyze their expression characteristics. On the other hand, microRNAs miRNAs play an important role in the post-transcriptional gene silencing of plant anti-virus defense response. It can mediate the miRNA cleavage or inhibit the translation of foreign virus gene with homologous sequence. As an important germplasm resource of high resistance to TMV, tobacco CV58(Vicotiana tabacum cv. CV58 has been identified and analyzed for its miRNA function. The main results of this study are as follows: 1. The identification of resistance to disease in tobacco varieties showed that the disease resistance of tobacco varieties CV58 was obvious in 3 days after infection with TMV, and the symptoms were similar to those of N gene. In order to identify the resistance gene, the CDS sequence and genome sequence of the resistance gene in tobacco CV58 were obtained by PCR homologous cloning. Sequence analysis showed that the resistance gene contained 3435 BP nucleotides and encoded 1145 amino acids. Sequence homology analysis showed that there was a 99% similarity with N gene. In order to further verify that the resistance of CV58 to TMV was caused by N gene, CRISPR/Cas9 knockout vector was constructed, and homozygous mutant plants with 2 and 3 bases missing target sites were obtained, respectively. After inoculation with TMV, the mutant tobacco plants showed mosaic symptoms due to loss of TMV resistance, and their temperature sensitivity was also lost. The gene was expressed in susceptible tobacco plant K326 by Agrobacterium tumefaciens-mediated method. After inoculation with TMV, N-like spots were also found, and they were temperature-sensitive. Finally, it was determined that the resistance of tobacco CV58 originated from N gene. 2.CV58 plants were inoculated with TMV or PBSs respectively. The total RNA was extracted and detected by Illumina Hiseq 2000 sequencing system, and then compared with the known database, the differentially expressed miRNAs in two samples of RNA were screened. The differentially expressed miRNA was selected. Divided into up-regulated and down-regulated groups, Target genes were predicted for selected miRNA, go enrichment analysis and KEGG analysis were carried out to predict possible signal pathways. Expression profile analysis showed that among 329 known miRNA with differential expression, there were 211 up-regulated genes. The down-regulation of 118 p0.05 miRNA(Fold-change1.00 and 72 miRNA differentially expressed profiles of 184 Fold-change-1.00 of 256 significantly different miRNA(Fold-change1.00; Informatics analysis of target genes pointing to plant-pathogenic bacteria interaction, cell development and division. There are 7 pathways such as R-mediated phagocytosis of resistance gene, which provide basis for further verification of the role of miRNA in the mechanism of plant antivirus. 3. TMV was used to infect the leaves of tobacco CV58. The stability of 14 candidate internal reference genes including 9 mature miRNAs and 5 traditional housekeeping genes were evaluated by GeNorm and NorFinder programs. The results showed that under the stress of TMV infection, the stability of 14 candidate reference genes in CV58 tissues and leaves of tobacco was evaluated. The most suitable internal reference gene for mature miRNA is L25 miR159, and the most suitable combination is L25 Ntubc2.
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S435.72;Q943.2

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