本文選題：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3　切入點：年齡相關(guān)性白內(nèi)障　出處：《南通大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的探索DNA氧化損傷清除基因谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3(glutathione S-transferase Mu 3,GSTM3)在年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract,ARC)患者晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LECs)和晶狀體皮質(zhì)中的表達及甲基化狀態(tài)與組蛋白修飾的改變,并分析其表達變化與表觀遺傳修飾的關(guān)系。方法采用臨床病例對照研究和細(xì)胞生物學(xué)研究。病例組為2014年9月-2015年9月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院眼科診斷為ARC,LOCSⅢ分級晶狀體混濁程度≥C4,并接受白內(nèi)障手術(shù)的患者,共120例120眼;對照組為本院眼科診斷為玻璃體視網(wǎng)膜疾病(如特發(fā)性黃斑前膜、特發(fā)性黃斑裂孔等),且同時在玻璃體切除手術(shù)中行透明晶狀體摘除者,以及來源于南通市紅十字眼庫新鮮眼球中的透明晶狀體,年齡、性別匹配,共40例40眼。于手術(shù)中取得晶狀體前囊膜及皮質(zhì),提取DNA、RNA和蛋白質(zhì)。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantificational real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)分析GSTM3 m RNA和蛋白質(zhì)表達水平,甲基化特異性PCR法(bisulfite-sequencing PCR,BSP)及焦磷酸測序法(pyrosequencing)檢測GSTM3 DNA甲基化狀態(tài)。用不同濃度過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)處理人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04和HLEB3,構(gòu)建氧化損傷模型,檢測SRA01/04和HLEB3中GSTM3的表達量變化及甲基化狀態(tài),染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)分析GSTM3組蛋白甲基化和乙�；揎棤顟B(tài),對HLEB3分別進行5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)去甲基化處理和曲古霉素(trichostatin A,TSA)抑制組蛋白去乙�；柑幚砗髾z測GSTM3蛋白質(zhì)表達量變化。凝膠電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)檢測GSTM3啟動子區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力。SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果晶狀體組織q RT-PCR及Western Blot結(jié)果表明,與對照組相比,三種類型ARC患者晶狀體LECs及皮質(zhì)中GSTM3表達量均下降(m RNA:F=308.90,P0.01;F=198.42,P0.01;蛋白質(zhì):F=219.74,P0.01;F=195.77,P0.01)。BSP分析及焦磷酸測序表明在ARC患者晶狀體LECs及皮質(zhì)中GSTM3啟動子區(qū)Cp G島呈現(xiàn)高甲基化(晶狀體LECs對照組:2.00±1.36,ARC-C:20.11±1.23,ARC-N:25.17±1.18,ARC-P:17.94±1.51,F=1138.44,P0.01;晶狀體皮質(zhì)對照組:4.72±1.49,ARC-C:19.80±1.26,ARC-N:26.75±1.02,ARC-P:20.03±1.36,F=1035.63,P0.01)。細(xì)胞生物學(xué)實驗結(jié)果表明:與SRA01/04相比,HLEB3中GSTM3表達量下降(t=14.48,P0.01;t=16.32,P0.01),相應(yīng)地,HLEB3中GSTM3啟動子區(qū)Cp G島呈現(xiàn)高甲基化(SRA01/04:1.25±0.67,HLEB3:20.58±1.07,t=26.51,P0.01)。與SRA01/04相比,HLEB3的H3K9三甲基化增高而H3乙酰化下降(t=19.21,P0.01;t=6.16,P0.01)。對HLEB3進行5-Aza-d C或TSA處理后,GSTM3蛋白質(zhì)表達量升高(t=7.24,P0.01;t=10.94,P0.01)。EMSA提示GSTM3啟動子區(qū)高甲基化阻礙轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。在人晶狀體上皮細(xì)胞株氧化損傷模型中GSTM3表達水平降低(m RNA:F=54.43,P0.01;F=66.82,P0.01;蛋白質(zhì):F=7.44,P0.01;F=30.62,P0.01),GSTM3啟動子區(qū)Cp G島甲基化水平升高(F=989.04,P0.01;F=595.94,P0.01)。結(jié)論GSTM3表達的下降可能與ARC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。GSTM3啟動子區(qū)Cp G島的DNA甲基化及組蛋白修飾可能調(diào)節(jié)其表達。結(jié)果提示調(diào)節(jié)表觀遺傳學(xué)的變化可作為ARC防治的新靶點。
[Abstract]:Objective to explore the oxidative damage of DNA scavenging gene glutathione S- transferase M3 (glutathione S-transferase Mu 3, GSTM3) in age-related cataract (age-related cataract, ARC) in lens epithelial cells (lens epithelial cells, with LECs) and lens cortex expression and methylation and histone modification changes, and to analyze its expression the change and the relationship between apparent genetic modification. Method of control research and cell biology by clinical cases. The case group for the September 2014 -2015 year in September in Hospital Affiliated to Nantong University diagnosed ARC, LOCS grade III lens opacity is larger than C4, and patients undergoing cataract surgery, 120 eyes of 120 cases; the control group for the hospital diagnosis vitreous body and retinal diseases (such as idiopathic epiretinal membrane, idiopathic macular hole etc.), and at the same time in the vitreous body resection in clear lens extraction, to Transparent lens, and from the Nantong City Red Cross yanku fresh eyeballs in age, gender, and a total of 40 eyes of 40 cases. In the operation in anterior lens capsule and cortex, extraction of DNA, RNA and protein. Real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (quantificational real-time polymerase chain reaction, Q RT-PCR) and Western blot (Western Blot GSTM3 m RNA) analysis and protein expression, methylation specific PCR (bisulfite-sequencing PCR BSP) and pyrosequencing (pyrosequencing) detection of GSTM3 DNA methylation state. With different concentrations of hydrogen peroxide (hydrogen peroxide, H2O2) SRA01/04 and HLEB3 human lens epithelial cells, establish the oxidative damage model that expression and methylation status of GSTM3 SRA01/04 and HLEB3, chromatin immunoprecipitation (chromatin immunoprecipitation, Ch IP) of GSTM3 group Histone methylation and acetylation status of HLEB3 were 5- aza -2'- deoxycytidine (5-Aza-2'-deoxycytidine, 5-Aza-dC) demethylation treatment and trichostatin (trichostatin A, TSA) histone deacetylase inhibition after treatment to detect GSTM3 protein expression change. Electrophoretic mobility shift assay (electrophoretic mobility shift assay, EMSA). The data analysis ability of.SPSS17.0 statistical software combined with detection of GSTM3 promoter region and transcription factor Q RT-PCR and Western the lens tissue Blot results showed that compared with the control group, three patients with type ARC lens LECs and cortical GSTM3 expression decreased (m RNA:F=308.90, P0.01; F=198.42, P0.01; protein: F=219.74, P0.01; F=195.77, P0.01).BSP analysis and pyrosequencing showed that patients with ARC and LECs in the lens cortex in the promoter region of the GSTM3 Cp island of G showed hypermethylation (lens LE Cs control group: 2 + 1.36, ARC-C:20.11 + 1.23, ARC-N:25.17 + 1.18, ARC-P:17.94 + 1.51, F=1138.44, P0.01; the lens cortex of control group: 4.72 + 1.49, ARC-C:19.80 + 1.26, ARC-N:26.75 + 1.02, ARC-P:20.03 + 1.36, F=1035.63, P0.01). Cell biology experiment results show that compared with SRA01/04, GSTM3 expression decreased HLEB3 (t=14.48, P0.01; t=16.32, P0.01), corresponding to HLEB3 in the promoter region of the GSTM3 Cp island of G showed high methylation (SRA01/04:1.25 + 0.67, HLEB3:20.58 + 1.07, t=26.51, P0.01). Compared with SRA01/04, H3K9 trimethyl HLEB3 of increased H3 acetylation decreased (t=19.21, P0.01; t=6.16 P0.01, 5-Aza-d C or TSA). After the treatment of HLEB3, GSTM3 protein expression increased (t=7.24, P0.01; t=10.94, P0.01).EMSA showed that the GSTM3 promoter hypermethylation hindering transcription factor binding in human lens epithelial cells. The expression of GSTM3 in the water oxidative damage model Ping (m RNA:F=54.43, P0.01 decreased; F=66.82, P0.01; F=7.44, P0.01; protein: F=30.62, P0.01, GSTM3) level of Cp promoter G island methylation of promoter region increased (F=989.04, P0.01; F=595.94, P0.01). The occurrence of DNA methylation and histone modifications related to the development of.GSTM3 Cp in the promoter region G island may decline conclusion ARC and GSTM3 expression may regulate its expression. It suggests that the adjustment of apparent change of genetics can become a new target for the prevention and treatment of ARC.

【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R776.1

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本文編號：1664784