本文選題：rho1基因　切入點(diǎn)：羅倫隱球酵母　出處：《浙江大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：細(xì)胞壁完整性(Cell wall integrity, CWI)信號(hào)通路是真菌中普遍存在一條保守通路,在生長、繁殖、對(duì)逆境脅迫的感受和調(diào)節(jié)中均具有重要作用。Rho1蛋白作為CWI通路的主要調(diào)節(jié)因子能夠與膜傳感器信號(hào)整合后激活下游MAPK信號(hào)通路,參與細(xì)胞壁合成等多種生理調(diào)控。羅倫隱球酵母是目前廣泛報(bào)道的一種用于果實(shí)采后病害的生防酵母,但因其遺傳背景尚不明確,導(dǎo)致其在基因水平上研究進(jìn)展緩慢。本課題通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)獲得羅倫隱球酵母的rhol基因序列,在序列分析的基礎(chǔ)上通過釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)羅倫隱球酵母rhol基因,探究rho1基因轉(zhuǎn)化在提高重組酵母抗逆性和生防效力方面的可行性,研究結(jié)果對(duì)于明確rho1在生防酵母逆境適應(yīng)和抑制果實(shí)病害中的作用等具有重要意義。主要研究結(jié)果如下：羅倫隱球酵母rho1基因序列和所編碼的蛋白結(jié)構(gòu)分析。通過對(duì)羅倫隱球酵母轉(zhuǎn)錄組高通量測序分析獲得rho1基因的cDNA序列為597 bp,運(yùn)用PCR擴(kuò)增得到rho1基因全長966 bp,包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子,在基因結(jié)構(gòu)上與新型隱球酵母及其相似；對(duì)羅倫隱球酵母Rho1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示：Rho1蛋白由199個(gè)氨基酸組成,存在典型小GTP結(jié)合蛋白保守結(jié)構(gòu)域,并有6個(gè)α1-螺旋結(jié)構(gòu)、6個(gè)p-折疊和5個(gè)Loop結(jié)構(gòu),與已知的Rho家族蛋白空間結(jié)構(gòu)相似,因此推斷羅倫隱球酵母Rho1蛋白與已知Rho家族蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。羅倫隱球酵母rho1基因克隆及在釀酒酵母中表達(dá)。用特異性引物擴(kuò)增得到rho1基因cDNA全長序列,利用Clonexpress高效的DNA定向克隆技術(shù)將rho1基因連接到載體上,并將重組載體通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞,在含有150μg/ml的殺稻瘟菌素的培養(yǎng)基篩選得到轉(zhuǎn)化子,測序鑒定后構(gòu)建重組釀酒酵母SC-rho1。重組釀酒酵母SC-rho1抗逆性和生防效力評(píng)價(jià)。重組釀酒酵母對(duì)溫度和滲透壓的耐受性明顯高于野生型釀酒酵母,同時(shí)在37℃和滲透壓脅迫下重組釀酒酵母能更加有效抑制梨果實(shí)病害,與野生型釀酒酵母相比分別將發(fā)病率降低了33%和25%,其機(jī)理可能與rho1基因過表達(dá)后提高CWI信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄效率有關(guān)。
[Abstract]:Cell wall integrity (Cell wall integrity, CWI) signaling pathway is a conserved pathway exists in fungi growth, reproduction, stress perception and regulation plays an important role as a major regulator of.Rho1 protein CWI pathway with membrane sensor signal integration after activation of downstream MAPK signaling pathway is involved in the cell. The physiological regulation of wall synthesis. C.laurentii is used for postharvest diseases of biocontrol yeast widely reported, but because of its genetic background is not clear, the slow progress of the study on the gene level. In this paper obtains the rhol gene sequence of c.laurentii by transcriptome technology, through the yeast expression system for heterologous expression of c.laurentii rhol gene on the basis of sequence analysis, explore the transformation of Rho1 gene in improving recombinant yeast resistance and biocontrol effect of the can For, the results is of great significance for the biocontrol yeast Rho1 in adversity adaptation and suppression of fruit diseases in action. The main results are as follows: the analysis of protein structure c.laurentii Rho1 gene sequence and encoding. The c.laurentii transcriptome high-throughput sequencing analysis of cDNA sequence of Rho1 gene for 597 BP, using PCR amplified Rho1 gene was 966 BP, contains 7 exons and 6 introns in the gene structure and Cryptococcus and similar; display of c.laurentii Rho1 protein structure prediction results: the Rho1 protein consists of 199 amino acids, are typical of small GTP binding protein conserved domain, and have 6 alpha helix structure of 1-, 6 p- and 5 Loop folding structure, similar to the Rho protein family known spatial structure, it is deduced that c.laurentii Rho1 protein with known Rho family proteins May have similar biological functions. Cloning of yeast Rho1 gene profile of ball Luo and expression in Saccharomyces cerevisiae. The full-length sequence of Rho1 gene cDNA with specific primers, using DNA Clonexpress efficient directional cloning the Rho1 gene was cloned into the vector, and the recombinant vector was transformed by electroporation into yeast competent cells. In the presence of 150 g/ml blasticidin medium screened transformants, sequencing the recombinant Saccharomyces cerevisiae SC-rho1. recombinant Saccharomyces cerevisiae SC-rho1 resistance and biocontrol efficacy evaluation of a recombinant Saccharomyces cerevisiae tolerance to temperature and osmotic pressure was significantly higher than that of wild type yeast, also at 37 degrees C and osmotic pressure under the stress of recombinant Saccharomyces cerevisiae can effectively inhibit pear fruit disease, compared with wild type yeast respectively incidence rate decreased by 33% and 25%, and its mechanism may be related to Rho1 gene The expression increases the transcriptional efficiency of the CWI signaling pathway.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TS261.11

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本文編號(hào)：1647334