本文選題：石杉堿甲　切入點：內(nèi)生真菌　出處：《江西師范大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：石杉堿甲(Huperzine A,HupA)是治療阿爾茨海默癥的生物堿類藥物。由于化學合成、石松屬植物栽培及細胞培養(yǎng)等生產(chǎn)技術(shù)無法突破,HupA僅能從野生蛇足石杉等石松屬植物中提取,存在原料短缺和環(huán)境破壞等嚴重問題,內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)HupA成為可供選擇的替代方式。生物合成途徑的闡明是采用基因組學、代謝工程、組合生物合成等現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ),但HupA等石松生物堿生物合成途徑尚未闡明。本研究以高產(chǎn)HupA的蛇足石杉內(nèi)生真菌Shiraia sp.Slf14為對象,對全基因組測序和生物信息學分析預(yù)測的編碼石杉堿甲生物合成中第一、二步反應(yīng)的關(guān)鍵酶—賴氨酸脫羧酶(Lysine decarboxylase,LDC)和銅胺氧化酶(copper amine oxidase,CAO)基因,開展其體外功能分析。根據(jù)全基因組序列信息獲得的LDC序列信息,本研究采用RT-PCR技術(shù),從Shiraia sp.Slf14中擴增得到長度為687 bp的LDC基因(GenBank ID:KT362170),并成功構(gòu)建大腸桿菌表達質(zhì)粒pET-22b-LDC與pET-32a-LDC,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli BL21(DE3),誘導表達出重組蛋白LDC與Trx-LDC。經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定分子量分別約24 kDa和42 kDa,與預(yù)計大小相符。通過Ni2+金屬親和層析純化重組LDC與Trx-LDC并建立酶促反應(yīng)體系,利用TLC檢測LDC催化活性,結(jié)果表明LDC與Trx-LDC均具有賴氨酸脫羧酶活性。利用生物信息學軟件分析了LDC的理化性質(zhì)及蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu):二級結(jié)構(gòu)顯示出α螺旋占37.3%,β折疊占11.4%,無規(guī)則卷曲為51.3%;從三維結(jié)構(gòu)看出LDC為二聚體結(jié)構(gòu),N端肽鏈暴露在蛋白表面,主要通過C端肽鏈相互作用形成二聚體�；谫嚢彼崦擊让傅陌被嵝蛄邢到y(tǒng)進化樹分析可知,Shiraia sp.Slf14的LDC與來源于Aspergillus clavatus NRRL 1的相應(yīng)蛋白的氨基酸序列相似度最高,和來自宿主植物Huperzia serrata的兩個LDC差異較大�；谌蚪M序列信息獲得的CAO基因相關(guān)信息,采用RT-PCR技術(shù)擴增得到銅胺氧化酶(SsCAO)基因,基因長度2031 bp,序列已提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(GenBank ID:KT362171)。成功構(gòu)建大腸桿菌表達載體pET-SsCAO并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli BL21(DE3),經(jīng)誘導表達出76 kDa大小的重組SsCAO蛋白質(zhì),與預(yù)測大小相吻合。重組SsCAO經(jīng)純化后構(gòu)建酶促反應(yīng)體系,GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)物5-氨基戊醛(5-aminopentanal),表明重組SsCAO具有催化活性。通過生物信息學分析其理化性質(zhì)和預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),SsCAO蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)顯示α-螺旋較集中于C/N兩端,β-折疊結(jié)構(gòu)所占比例較大。分析SsCAO的氨基酸序列發(fā)現(xiàn),其含有CAO家族的保守序列Asn-Tyr-Asp/Glu,His447、His449、His607和Tyr299,Lys309 and Asp313。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明SsCAO與匐柄霉屬Stemphylium lycopersici CAO關(guān)系最近,與H.serrata CAO和其他的植物CAOs相距較遠。本文對LDC和SsCAO的研究不僅為內(nèi)生真菌石杉堿甲生物合成機制提供參考數(shù)據(jù),同時也為HupA的合成生物學研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Huperzine (Huperzine HupA) is an alkaloid drug for the treatment of Alzheimer's disease. Due to chemical synthesis, the production techniques such as cultivation and cell culture of Pinus can not break through the production of HupA. There are serious problems such as shortage of raw materials and environmental damage. Endophytic fungi fermentation to produce HupA is an alternative alternative. The biosynthesis pathway is elucidated by using genomics, metabolic engineering, and so on. The basis of production of metabolites by combining biosynthesis and other modern biological techniques, but the biosynthesis pathway of alkaloids of Pinus lanceolata such as HupA has not been elucidated. In this study, the endophytic fungus Shiraia sp.Slf14, which produces high HupA, was used as an object. The Lysine decarboxylase LDCand copper amine oxidase copper amine oxidase CAO genes were predicted for the first and second step reaction of Huperzine A biosynthesis by whole genome sequencing and bioinformatics analysis. According to the LDC sequence information obtained from the whole genome sequence information, the RT-PCR technique was used in this study. A 687bp LDC gene named IDKT362170 was amplified from Shiraia sp.Slf14. The E. coli expression plasmids pET-22b-LDC and pET-32a-LDCwere successfully constructed, and the recombinant protein LDC and Trx-LDCwere induced to express the recombinant protein LDC and Trx-LDC. the molecular weights were about 24 kDa by SDS-PAGE electrophoresis. The recombinant LDC and Trx-LDC were purified by Ni2 metal affinity chromatography and the enzymatic reaction system was established. TLC was used to detect the catalytic activity of LDC. The results showed that both LDC and Trx-LDC had lysine decarboxylase activities. The physicochemical properties and protein spatial structure of LDC were analyzed by bioinformatics software. The secondary structure showed that 偽 helix was 37.3cm, 尾 folding 11.4g and irregular crimp 51.3; According to the three-dimensional structure, the N-terminal peptide chain of LDC is a dimer structure exposed to the surface of the protein. The amino acid sequence phylogenetic tree analysis based on lysine decarboxylase showed that LDC of Shiraia sp.Slf14 had the highest amino acid sequence similarity with the corresponding protein from Aspergillus clavatus NRRL 1. Based on the relative information of CAO gene obtained from the whole genome sequence, the copper amine oxidase gene SsCAO) gene was amplified by RT-PCR technique. The length of the gene was 2031 BP, and the sequence was submitted to the NCBI database (GenBank: IDKT362171). The E. coli expression vector pET-SsCAO was successfully constructed and transformed into E. coli BL21DE-3, and the recombinant SsCAO protein with the size of 76 kDa was induced and expressed. After purification of recombinant SsCAO, the enzymatic reaction system (GC-MS) was used to detect the product of 5-aminopentanalanalen, which indicated that the recombinant SsCAO had catalytic activity. The physicochemical properties of recombinant SsCAO were analyzed by bioinformatics and the predicted protein was predicted. The secondary and three-dimensional structures of SsCAO protein showed that 偽 -helix was concentrated at the two ends of C / N, and 尾 -fold structure occupied a large proportion. The amino acid sequence of SsCAO was found. The conserved sequences of Asn-Tyr-Asp.Gluus His447, His449, His607 and Tyr299Lys309 and Asp313. phylogenetic tree analysis showed that SsCAO had the closest relationship with Stemphylium lycopersici CAO. The study on LDC and SsCAO not only provided reference data for the biosynthesis mechanism of endophytic fungi Huperzine A, but also laid a foundation for the study of synthetic biology of HupA.
【學位授予單位】：江西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q93;Q78

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本文編號：1631319