本文關(guān)鍵詞：報(bào)告基因熒光素酶在科研中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

·715·

〖綜述·講座〗

報(bào)告基因熒光素酶在科研中的應(yīng)用

杜彥艷,　單保恩

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心,河北石家莊050011

Reportergeneluciferaseinapplicationofscientificresearch

DUYan-yan,SHANBao-en

ResearchCenter,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,P.R.China【摘要】　目的:總結(jié)報(bào)告基因熒光素酶在醫(yī)學(xué)研究中的新進(jìn)展。方法:應(yīng)用pubmed及CNKI期刊全文數(shù)據(jù)庫,以“報(bào)告基因和熒光素酶”為關(guān)鍵詞,檢索1996-01-2007-12相關(guān)文獻(xiàn),共收集文獻(xiàn)617篇。納入標(biāo)準(zhǔn):1)熒光素酶的生物學(xué)特性;2)熒光素酶作為報(bào)告基因的應(yīng)用。根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn),精選55篇文獻(xiàn),并查看每篇文獻(xiàn)后的引文,最后納入19篇文獻(xiàn)進(jìn)行了綜述。結(jié)果:熒光素酶是在氧氣存在下使底物發(fā)光的一類酶,該酶類與底物的結(jié)合特異性很強(qiáng),檢出的靈敏度高,因沒有激發(fā)光的非特異性干擾,信噪比較高,具有其他報(bào)告基因不可替代的優(yōu)勢(shì),在基因工程研究中被廣泛作為報(bào)告基因用于單個(gè)細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因生物、動(dòng)物和人體基因表達(dá)的實(shí)時(shí)、低光成像,是一種非常實(shí)用的研究方法。結(jié)論:熒光素酶作為報(bào)告基因顯示出良好的前景,已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要工具,特別是對(duì)推動(dòng)基因工程研究的發(fā)展具有重要作用。

中華腫瘤防治雜志,2009,16(9):715-718

[ABSTRACT]　OBJECTIVE:Toreviewadvancesofreportergeneluciferaseinthenewprogressinthescientificresearch.METH-ODS:Luciferase-relatedliteraturewasretrievedinPubMedandcnkifrom1996.1to2007.12.Keywordswerereportergeneandluciferase,and617articalsweregottogether.Theincludedcrite-ria:1)Luciferasebiologicalcharacteristics.2)Luciferaseapplica-tionasreportergene.Fifty-fivepaperswerefurtherstudied,andofwhichreferenceswerelookedfor.Finally19documentswerere-viewed.RESULTS:Luciferasesareenzymesthatemitlightinthepresenceofoxygenandasubstrate(luciferin),andwhicharehigh-lyspecificandhavehighsensitivity,andintheabsenceofexcitationlight,theyhavenon-specificinterference,sothesignal-noiseratioishigh.Theyhaveirreplaceableadvantagestootherreportergenes.Theyhavebeenwidelyusedforreal-time,low-lightimagingofgeneexpressionincellcultures,individualcells,wholeorgan-isms,andtransgenicorganisms.Itisaverypracticalresearchmethod.CONCLUSION:Luciferaseasareportergenehasshowngoodprospects,ithasyetbecomeanimportanttoolinthescientificresearchfields,andhaspromotedthegeneticengineeringresearchinparticular.

ChinJCancerPrevTreat,2009,16(9):715-718

【關(guān)鍵詞】　基因,報(bào)告;熒光素酶類;綜述文獻(xiàn)

[KEYWORDS]　genes,reporter;luciferases;reviewliterature

【中圖分類號(hào)】　R73-3　　　【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】　A　　　【文章編號(hào)】　1673-5269(2009)09-0715-04

　　報(bào)告基因是一種易于檢測(cè)蛋白質(zhì)或酶等表達(dá)產(chǎn)物的基因。把報(bào)告基因的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列融合形成嵌合基因,或與其他目的基因融合,在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá),通過報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定

【第一作者簡(jiǎn)介】　杜彥艷,女,河北正定人,主要從事抗腫瘤中藥的研究工作。Tel:86-311-86095290

E-mail:duyanyan9868@hotmail.com

【通訊作者簡(jiǎn)介】　單保恩,男,河北邯鄲人,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事腫瘤免疫學(xué)和抗腫瘤中藥的研究工作。T

目的基因的表達(dá)狀況。作為報(bào)告基因,在遺傳選擇和

篩選檢測(cè)方面必須具有以下幾個(gè)條件:1)已被克隆或全序列已被測(cè)定;2)表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中不存在,在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中無相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物;3)其表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測(cè)定。在轉(zhuǎn)基因、基因啟動(dòng)子分析以及藥物篩選等領(lǐng)域,由于報(bào)告基因技術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)方便等特點(diǎn),已被廣泛的應(yīng)用。

1　熒光素酶的來源和性質(zhì)

熒光素酶是生物體內(nèi)催化熒光素(luciferin)或脂肪醛(fireflyaldehyde)氧化發(fā)光的一類酶的總稱,來

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杜彥艷,等　報(bào)告基因熒光素酶在科研中的應(yīng)用

同,可將熒光素酶分為螢火蟲熒光素酶(fireflylucifer-ase,FL)和細(xì)菌熒光素酶(bacterialluciferase,

[1]BL)。細(xì)菌熒光素酶對(duì)熱敏感,因此在哺乳細(xì)胞的

在研究非甾體抗炎藥(NSAIDs)塞來考昔的抗結(jié)腸癌

作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn),它可以通過抑制Survivin基因的表達(dá),誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步通過PCR方法將Survivin基因啟動(dòng)子相對(duì)于5′起始密碼子上游的-1594/-18bp區(qū)從人類基因組DNA中擴(kuò)增出來,亞克隆到螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體(pGL3-Basic),合成pGL3-1594(-1594/-18bp)質(zhì)粒;再通過PCR方法從pGL3-1594(-1594/-18bp)質(zhì)粒中得到一系列包含Survivin不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子的質(zhì)粒(-418/-18、-326/-18、-211/-18、-75/-18、-65/-18、-55/-18、-45/-18和-34/-18bp),將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞18h后,用塞來考昔作用24h,通過監(jiān)測(cè)熒光素酶的活性來了解Survivin的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),塞來考昔可明顯降低Sur-vivin的表達(dá)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,其作用是通過抑制Survivin基因啟動(dòng)子中相對(duì)于起始密碼子-75/-66bp區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性起作用的。

Jiang等

[7]

應(yīng)用中受到限制。目前,以北美螢火蟲(NorthA-mericafirefly)來源的熒光素酶基因應(yīng)用的最為廣泛,該基因可編碼產(chǎn)生550個(gè)氨基酸的熒光素酶蛋白[3]。近年來,在深海中又發(fā)現(xiàn)了海洋腔腸熒光素酶,它所催化的底物海洋腔腸熒光素具有膜通透性,且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中無內(nèi)源性活力,是保持活細(xì)胞完整性最佳的報(bào)告基因

[4]

[2]

。

2　熒光素酶的發(fā)光機(jī)制

生物熒光實(shí)質(zhì)是一種化學(xué)熒光[3]。BL以脂肪醛(RCHO)為底物,在還原型黃素單核苷酸(FMNH2)及氧的參與下,使脂肪醛在被氧化為脂肪酸的同時(shí)放出光子,產(chǎn)生490nm的熒光

RCHO+O2+FMNH2　BL

[1]

,其化學(xué)反應(yīng)式如下。

※　RCOOH+H2O+FMN+光

2+

　　FL基因來自螢火蟲,在Mg、ATP、O2的參與

用Luciferase法檢測(cè)胃癌細(xì)胞

下,催化D-熒光素(D-luciferin)氧化脫羧,產(chǎn)生激活態(tài)的氧化熒光素,并放出光子,產(chǎn)生550～580nm的熒光[1],其化學(xué)反應(yīng)式如下。

D-熒光素+ATP+O2

FL、Mg

2+

BGC-823端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性

時(shí)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染hTERT啟動(dòng)子基因的細(xì)胞用多西紫杉醇作用0、6、12、24、36和48h后,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),Luc/β-gal值逐漸減小,表現(xiàn)出時(shí)間依賴性的抑制作用,表明多西紫杉醇抑制端粒酶及其亞基基因的表達(dá)是對(duì)hTERT啟動(dòng)子活性抑制作用的可能機(jī)制之一。

4.2　熒光素酶基因標(biāo)記細(xì)胞

報(bào)告基因技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于體外監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,以及與基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)。理論上,機(jī)體內(nèi)任何一種細(xì)胞(尤其是癌細(xì)胞、造血細(xì)胞、干細(xì)胞等)在體外(如基因轉(zhuǎn)染)或體內(nèi)(如直接注射)標(biāo)記上熒光素酶后,都可以通過閃爍計(jì)數(shù)器或分子成像技術(shù)進(jìn)行定量或體內(nèi)跟蹤,以了解細(xì)胞的增殖反應(yīng)強(qiáng)度以及其在體內(nèi)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移規(guī)律,或利用細(xì)胞(主要是免疫細(xì)胞)進(jìn)行生物治療等。Ozawa等[8]在研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)不同疾病的細(xì)胞和基因治療中,通過遺傳修飾MSCs,使它產(chǎn)生編碼單純皰疹病毒胸苷激酶的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,即VP-MSCs,從而增強(qiáng)全身性癌基因殺傷療法(systemicsuicidecancergenetherapy)的治療效果。為了評(píng)估MSCs的腫瘤趨向性,用熒光素酶分別標(biāo)記MSCs和VP-MSCs,于左心室注射神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞9L的荷瘤裸鼠后,用活體內(nèi)成像分析表明,轉(zhuǎn)基因在裸鼠9L皮下腫瘤內(nèi)積聚,并且VP-MSCs比MSCs產(chǎn)生更強(qiáng)的生物熒光信號(hào),說明VP-MSCs的療效更佳,為MSCs對(duì)不同疾病的細(xì)胞和基因治療效果觀察提供了更科學(xué)的依據(jù)。

[2]

※氧化熒光素

+CO2+AMP+Pi+光

　　這種無需激發(fā)光就可發(fā)出偏紅色的生物熒光,其組織穿透能力明顯強(qiáng)于綠色熒光蛋白(GFP)。熒光素

酶是靠酶和底物的相互反應(yīng)發(fā)光,特異性很強(qiáng),靈敏度高,由于沒有激發(fā)光的非特異性干擾,信噪比也比較高。

3　熒光素酶的檢測(cè)方法

依賴生物發(fā)光特性,利用閃爍計(jì)數(shù)器(scintillationcounter)對(duì)熒光素酶的活性作出定量檢測(cè)[5]。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下,加入超量底物,經(jīng)一定時(shí)間內(nèi),熒光閃爍總數(shù)與樣品中存在熒光素酶的活性成正比。另外,也可以采用光自顯影法對(duì)熒光素酶進(jìn)行定性檢測(cè)[4]。

4　應(yīng)用

熒光素酶基因可用于標(biāo)記基因、細(xì)胞和活體動(dòng)物。標(biāo)記方法是通過分子生物學(xué)克隆技術(shù),將熒光素酶基因插到預(yù)期分析的細(xì)胞染色體內(nèi),通過單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選,培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株。由于現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)儀器可以檢測(cè)到10-19mol的熒光素酶,所以應(yīng)用該方法的靈敏度很高。

4.1　熒光素酶基因標(biāo)記基因

熒光素酶基因插入不同基因啟動(dòng)子(promoter)之后,成為該基因表達(dá)的報(bào)告基因,通過監(jiān)測(cè)報(bào)告基因可[6]

將熒光素酶基因標(biāo)記微生物后,可以對(duì)標(biāo)記有熒光素酶的微生物(如腺病毒、細(xì)菌等)進(jìn)行示蹤,了解他們?cè)跈C(jī)體內(nèi)的傳播規(guī)律以及藥物對(duì)他們的作用。因?yàn)樗赖奈⑸锊荒鼙磉_(dá)報(bào)告基因,所以可以通過觀察報(bào)告基因的消失來判斷藥物療效。這個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域?qū)?huì)更加有助于在不同水平深入了解宿主-微生物的相互作用。Saeij等

[9]

、、反應(yīng)速度、監(jiān)測(cè)靈敏度、線性范圍和儀器需要等要求,使用標(biāo)準(zhǔn)的手工熒光照度儀可在30s內(nèi)完成測(cè)試。目前,這套系統(tǒng)已開始商品化。Parsons等在同時(shí)評(píng)價(jià)藥物在兩種不同G蛋白偶聯(lián)受體亞型的活性時(shí)使用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),分別構(gòu)建了轉(zhuǎn)染人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素1(hCRH1)受體和螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因或hCRH2和海腎熒光素酶報(bào)告基因的穩(wěn)定細(xì)胞系,這些細(xì)胞系可以分別提供針對(duì)CRH1和CRH2受體不同的熒光素酶計(jì)數(shù);而且在接受不同刺激后,可以在96孔板中直接進(jìn)行高通量熒光素酶發(fā)光測(cè)定。結(jié)果顯示,非選擇性CRH拮抗劑可以阻斷增效劑誘導(dǎo)的CRH1和CRH2受體熒光素酶的增加,而選擇性CRH1拮抗劑僅阻斷特異性CRH1增效劑蛙皮降壓肽誘導(dǎo)的CRH1受體熒光素酶的增加。這些數(shù)據(jù)提示CRH1和CRH2受體的不同藥理學(xué)特性。這種方法也使在同一塊96孔板中同時(shí)研究?jī)煞N受體亞型成為可能。為雙熒光報(bào)告系統(tǒng)用于基礎(chǔ)研究和復(fù)合物篩選提供了依據(jù)。

[14]

[15]

用熒光素酶分別標(biāo)記兩種不同

菌種S22和S23的鼠弓形體并且感染小鼠,發(fā)現(xiàn)它們?cè)谛∈篌w內(nèi)具有不同的繁殖、播散和再活化特點(diǎn)。為研究病原微生物感染進(jìn)程、發(fā)病機(jī)制和宿主對(duì)疾病的反應(yīng)提供了新的思路。4.4　活體生物體內(nèi)成像

活體動(dòng)物生物發(fā)光的檢測(cè),需要一套活體成像系統(tǒng),它是由一個(gè)高度靈敏的冷CCD(charge-coupleddevice)相機(jī),特別設(shè)計(jì)的成像暗箱和成像軟件組成。成像軟件可以分析、組織和儲(chǔ)存數(shù)據(jù)。

熒光素酶基因(LUC)標(biāo)記的基因、細(xì)胞和動(dòng)物,使科研人員能夠通過活體生物體成像系統(tǒng)直接監(jiān)控生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。特別是在各種類型的腫瘤研究中,能夠直接快速地測(cè)量各種腫瘤動(dòng)物模型中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移狀態(tài),并可對(duì)治療中腫瘤細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估。能夠無創(chuàng)傷對(duì)動(dòng)物整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤進(jìn)行檢測(cè)及計(jì)量,即使微小的遷移也能被檢出[10-11]。傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法需要在不同時(shí)間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以獲得數(shù)據(jù),得到多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相比之下,體內(nèi)可見光成像通過對(duì)同一組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄,跟蹤同一觀察目標(biāo)(標(biāo)記細(xì)胞及基因)的移動(dòng)及變化,由于能夠?qū)ν粍?dòng)物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè),在最大程度上減少了不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間的個(gè)體差異以及傳統(tǒng)檢測(cè)方法的誤差所造成的對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,更重要的是活體生物螢光成像技術(shù)的敏感性極高。Edinger等

[12]

圖1　生物發(fā)光成像體外顯示大鼠腫瘤以及大組織標(biāo)本

A:大鼠體外腫瘤的位置;B:處死大鼠后解剖所示腫瘤位置

4.6　藥物篩選

近年來,細(xì)胞因子作為新藥研究和開發(fā)逐漸成為研究熱點(diǎn)。由于有機(jī)小分子化合物具有高效、安全、成本低和穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),通過高效和特異的篩藥模型篩選有機(jī)小分子化合物成為新藥研制領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題。隨著基因組及蛋白組學(xué)研究的不斷進(jìn)展,為新藥研究提供了大量靶標(biāo),而在靶標(biāo)的分子生物學(xué)研究取得的成果使得對(duì)靶標(biāo)基因表達(dá)更精確、更敏感、更微觀調(diào)控元件的研究成為可能[16]。熒光素酶則滿足了藥物篩選的特異靶點(diǎn)、高敏感性、高通量的要求[17]。Tian等進(jìn)行的新藥篩選工作就是基于造血生長(zhǎng)因子及其受體JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),以人工合成的4個(gè)拷貝的STAT結(jié)合序列為調(diào)控序列,以熒光素酶基因?yàn)閳?bào)告基因,將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)染粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)受體的4B6細(xì)胞中。利用此細(xì)胞進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有機(jī)小分子SB247464,該分-,[18]

報(bào)道,活體生物

螢光成像技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的敏感性甚至超過了流式

細(xì)胞儀。Zeamari等[13]用非侵襲性生物發(fā)光成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染了熒光素酶的CC531結(jié)腸癌細(xì)胞在WAG/RIJD大鼠腹腔的增長(zhǎng)情況,結(jié)果顯示,檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)與處死動(dòng)物后解剖觀察腹膜腔而得到的對(duì)腫瘤鑒定具有很好的相關(guān)性(圖1),為科研工作者使用活體生物體內(nèi)成像技術(shù)提供了依據(jù)。

4.5　雙熒光報(bào)告系統(tǒng)

理想的雙報(bào)告基因方法使研究者能夠以螢火蟲熒光素酶所具有的速度、靈敏度和線性范圍對(duì)同一樣品中的兩個(gè)報(bào)告基因同時(shí)測(cè)定,這在傳統(tǒng)的報(bào)告基因如

(CAT)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)萄糖醛酸糖苷酶GUS)等均由于其測(cè)試化學(xué)、求等所固有的局限性是不可能達(dá)到的。隨著對(duì)海洋腔,

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杜彥艷,等　報(bào)告基因熒光素酶在科研中的應(yīng)用

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因表達(dá)。避免了有機(jī)大分子類藥物不宜口服、毒性較

大等缺點(diǎn),并且可以SB247464為先導(dǎo)化合,經(jīng)過組合化學(xué)方法的改造完善其結(jié)構(gòu),易得到高活性的有機(jī)小分子化合物。

Ashutosh等[19]構(gòu)建了表達(dá)熒光素酶基因的杜利氏曼原蟲模型,從而可以實(shí)現(xiàn)體外抗杜利氏曼原蟲的高通量藥物篩選,彌補(bǔ)了過去抗杜利氏曼原蟲藥物篩選技術(shù)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力和難于定量檢測(cè)的不足。這種方法為科研工作者使用熒光素酶進(jìn)行高通量藥物篩選提供了依據(jù)。

5　展望

隨著報(bào)告基因技術(shù)的發(fā)展、檢測(cè)方法的改進(jìn)以及更多無毒害報(bào)告基因的發(fā)現(xiàn),相信在不遠(yuǎn)的將來,報(bào)告基因技術(shù)也將會(huì)作為新技術(shù)用于臨床實(shí)踐,擴(kuò)展到臨床檢驗(yàn)及藥物治療等領(lǐng)域,服務(wù)于人類的醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)。

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2005,

收稿日期:2008-10-30　修回日期:2009-02-05

(編輯:史本玲)

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  本文關(guān)鍵詞：報(bào)告基因熒光素酶在科研中的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：161935