本文選題：miR-382　切入點：GC-1　出處：《西北農林科技大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：miRNA是一類具有調控作用的非編碼小RNA,它通過與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)結合調控基因的表達。已有研究表明miR-382參與調控多種細胞的增殖,抑制腫瘤細胞的侵襲。為了探究miR-382對小鼠精原細胞的增殖調控作用,本研究使用生物信息學預測了miR-382-5p的潛在靶基因,并使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行驗證;通過轉染miR-382-5p的類似物與阻抑物,使用CCK-8與EdU試驗檢測了mi R-382-5p對小鼠精原細胞的細胞活力與增殖能力的影響;通過RT-qPCR檢測了豬睪丸中Kmt5a基因在不同發(fā)育階段與不同細胞類型中的表達情況;使用分子克隆測序與生物信息學分析探究了Kmt5a基因剪接變體的分子結構差異。主要結果如下:1、miR-382-5p的預測靶基因為Kmt5a、Top1,通過雙熒光素酶試驗證明了Kmt5a是miR-382-5p的一個靶基因,而Top1不是。2、細胞活力與增殖能力檢測結果表明,與對照組相比,miR-382-5p mimics在120nmol/L的條件下能降低GC-1 spg細胞的活力13.4%(p0.05),并降低GC-1 spg細胞的增殖能力8.6%(p0.05),而miR-382-5p inhibitor不能顯著提高GC-1 spg細胞的活力和增殖能力(p0.05)。3、RT-qPCR與Western Blotting試驗表明,miR-382-5p mimics在120 nmol/L的條件下能下調靶基因Kmt5a在GC-1spg細胞中的mRNA相對含量39.8%(p0.05),下調KMT5A蛋白表達量36.5%。4、Kmt5a在7日齡豬睪丸支持細胞中的mRNA表達量顯著高于間質細胞和性原細胞(p0.05),在5月齡豬睪丸中相對含量顯著高于7日齡與2月齡(p0.05)。5、DNA測序結果表明Kmt5a基因在豬睪丸中存在兩個剪接變體,即Kmt5a-X1,Kmt5a-X2,蛋白二維結構分析表明KMT5A-X1缺少N端的PIP(PCNA-interacting motifs)box1。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)Kmt5a基因是miR-382-5p的一個靶基因,miR-382-5p能夠調控GC-1 spg細胞的增殖。因此,miR-382靶向Kmt5a基因調控小鼠精原細胞的增殖。同時,在不同發(fā)育階段的豬睪丸中,Kmt5a的表達量隨著年齡的增加而上升;Kmt5a基因在豬睪丸中存在兩個剪接變體,其中剪接變體KMT5A-X1缺少N端的PIP box1。本研究結果豐富了miRNA在精原細胞增殖過程中的調控網絡,為進一步解析雄性動物精子發(fā)生提供初步的實驗依據(jù)。
[Abstract]:MiRNA is a kind of non-coding small RNAs that can regulate the expression of genes by binding to the 3UTR region of the target gene mRNA. It has been shown that miR-382 is involved in regulating the proliferation of many kinds of cells. In order to investigate the effect of miR-382 on the proliferation of mouse spermatogonia, we used bioinformatics to predict the potential target gene of miR-382-5p, which was verified by double luciferase report system. The effects of miR-382-5p on the viability and proliferation of mouse spermatogonium cells were detected by CCK-8 and EdU tests. The expression of Kmt5a gene in pig testis was detected by RT-qPCR in different development stages and different cell types. Molecular structural differences of splicing variants of Kmt5a gene were explored by molecular cloning sequencing and bioinformatics analysis. The main results were as follows: 1) the predicted target of Kmt5a gene was Kmt5aTiTop1. It was proved by double luciferase test that Kmt5a was a target gene of miR-382-5p. However, Top1 was not. 2. The results of cell viability and proliferation test showed that, Compared with the control group, miR-382-5p mimics decreased the activity of GC-1 spg cells at 120nmol / L and decreased the proliferative ability of GC-1 spg cells by 8.6p0.05p, while miR-382-5p inhibitor could not significantly improve the viability and proliferation of GC-1 spg cells by RT-qPCR and Western Blotting test. Under the condition of 120 nmol/L, the relative content of mRNA of target gene Kmt5a in GC-1spg cells was down-regulated by 39.8%, and the expression of KMT5A protein was down regulated by 36.5%. The expression of Kmt5a in 7-day-old pig testicular Sertoli cells was significantly higher than that of interstitial cells and sex proto-cells p0.05a, and the expression of KMT5A protein in 5-month-old pigs was significantly higher than that of P0.05A cells. The relative content of Kmt5a in testis was significantly higher than that in 7 days and 2 months of age. The results showed that there were two splicing variants of Kmt5a gene in pig testis. That is, Kmt5a-X1 + Kmt5a-X2, the two-dimensional protein structure analysis shows that KMT5A-X1 lacks N-terminal PIP(PCNA-interacting motifs box1.In conclusion, we found that Kmt5a gene is a target gene of miR-382-5p, miR-382-5p can regulate the proliferation of GC-1 spg cells. Therefore, the Kmt5a gene targeting miR-382 regulates the proliferation of mouse spermatogonia. The expression of Kmt5a gene increased with age in pig testis at different developmental stages. There were two splicing variants of Kmt5a gene in pig testis. The splicing variant KMT5A-X1 lacks N-terminal PIP box1.This study enriches the regulatory network of miRNA in the process of spermatogonia proliferation and provides a preliminary experimental basis for further analysis of spermatogenesis in male animals.
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S814

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本文編號：1618855