發(fā)布時間：2018-03-16 00:07

  本文選題：甘蔗　切入點：根系　出處：《廣西大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：甘蔗(Saccharum officenarum L.)是中國乃至世界第一大糖料作物,也是重要的能源作物。甘蔗是喜溫作物,廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū),需要適宜的溫度和濕度才能正常生長。近年來,世界氣候變化異常,極端低溫頻發(fā),寒害、凍害增多,給甘蔗生產造成巨大的損失。因此,開展甘蔗抗寒機制的研究具有重要的意義。目前,國內外對甘蔗低溫脅迫下根系的形態(tài)、解剖、生理生化代謝和分子水平等方面研究的綜合報道較少,本研究對甘蔗幼苗進行低溫脅迫處理,從根系形態(tài)、細胞亞顯微結構、生理生化代謝水平與常溫下生長的甘蔗進行比較分析,以期探討低溫脅迫下甘蔗根系的生長、生理生化特性以及相關基因等指標與抗寒性的關系；并對甘蔗微管蛋白α-tubulin基因進行克隆和表達分析,同時對該蛋白進行原核表達、純化并制備單克隆抗體；利用農桿菌介導法在煙草和甘蔗上進行遺傳轉化,初步驗證α-tubulin基因在植物耐寒性等的功能。主要的研究內容與結果如下：1.低溫抑制了根系的生長。與正常條件生長的對照根系相比,低溫脅迫下的根系表現根尖發(fā)黃,褐化,壞死；根長和根體積的增加量均顯著低于對照；兩個甘蔗品種(ROC22和GT28)的生物量均比對照明顯降低,但根冠比差異不顯著；兩個品種相比較,發(fā)現ROC22地上部和地下部受低溫影響顯著高于GT28；超微結構觀察結果顯示：低溫脅迫導致根尖細胞由方變圓,結構紊亂,細胞器減少,細胞膜破壞,細胞核解體,線粒體內嵴模糊,逐漸成為空泡狀,部分溶解,ROC22細胞和細胞器受傷害程度大于GT28。2.低溫明顯影響甘蔗根系蛋白質、糖含量以及蛋白酶活性。在低溫脅迫下,ROC22可溶性蛋白質先略微上升后下降,GT28可溶性蛋白質先升高后下降再升高,且保持在較高水平；ROC22氨基酸含量表現為先升高后降低,在第5和9 d顯著低于對照,而GT28的氨基酸含量則始終高于對照。ROC22的可溶性糖和非可溶性糖含量逐漸下降,與對照差異顯著,而GT28中可溶性糖逐漸上升,并高于對照組,但非可溶性糖含量則先上升后下降。根系中肽鏈內切酶活性先升高后下降,在弱酸性條件活性高于堿性條件下,并且GT28活性普遍高于ROC22；羧肽酶和氨肽酶在短時間低溫下變化不顯著,但在第9 d時ROC22羧肽酶活性激增,氨肽酶活性速降,GT28中這兩個酶活性變化不顯著。3.成功構建pET30a(+)-α-tubulin原核表達載體,利用IPTG誘導產生融合蛋白,原核表達結果顯示重組的pET30a(+)-α-tubulin為49.6kDa。重組蛋白通過Ni2+-NTA柱親和層析純化和透析濃縮后制備單克隆抗體,用ELISA法檢測α-tubulin單克隆的效價,結果表明本研究所制備的α-tubulin單克隆抗體的效價高于1：512000。用Western Blot檢測甘蔗α-微管蛋白獲得了特異性的條帶,說明甘蔗α-微管蛋白單克隆抗體已被成功制備。4.利用qRT-PCR技術分析了α-tubulin基因在甘蔗中轉錄水平的表達,結果表明α-tubulin基因在甘蔗莖中的表達量最高,根中次之,葉中最少。低溫脅迫下,α-tubulin基因在根、莖和葉中的表達量是先升高后降低,最后差異逐漸減小。利用Western Blot方法檢測α-tubulin基因在甘蔗中蛋白質水平的表達,發(fā)現ROC22根中α-微管蛋白表達逐漸下降,而GT28中α-微管蛋白先升高后下降,但都高于對照。5.成功構建了煙草表達載體pBI121-α-tubulin和甘蔗表達載體pCAMBIA3300-α-tubulin。將分別受CaMV35S和Ubi啟動子控制的pBI121-α-tubulin和pCAMBIA3300-α-tubulin通過運用農桿菌介導法轉入野生型煙草植株K346和甘蔗品種ROC22,經PCR檢測和GFP觀察以及Bar基因檢測確證獲得轉基因煙草和甘蔗。6.對轉α-tubulin基因煙草進行低溫脅迫的功能驗證。野生型和轉基因煙草分別進行28℃(常溫)和0-4℃(低溫)處理,結果表明：低溫脅迫對野生型和轉基因型煙草葉綠素含量影響不顯著。常溫下,轉基因煙草凈光合作用顯著高于野生型煙草,Pn、Gs、Tr顯著高于野生型,而Ci顯著低于野生型煙草。低溫脅迫下,野生型和轉基因煙草的光合作用受到抑制,并且都以呼吸作用為主,由強變弱后穩(wěn)定。低溫下,滲透物質可溶性蛋白質、可溶性糖和脯氨酸含量在轉基因煙草中比野生型煙草中穩(wěn)定。保護酶系統(tǒng)SOD和POD活性先升高后下降,但野生型煙草變化幅度顯著高于轉基因煙草；野生型煙草CAT活性逐漸下降,而轉基因煙草CAT活性先下降后激增。說明α-tubulin的過量表達影響植物體內生理生化特性。7.利用qRT-PCR技術對轉甘蔗α-tubulin基因的煙草進行表達分析,發(fā)現α-tubulin基因在兩種基因型煙草葉脈中表達最高,莖中次之,葉中最低；轉基因煙草葉和莖中α-tubulin基因表達顯著高于野生型煙草,而葉脈中α-tubulin基因表達低于野生型煙草。低溫脅迫下,野生型煙草葉片中α-tubulin基因表達逐漸降低,而轉基因煙草葉片中α-tubulin基因表達有升有降,但顯著高于野生型煙草。Western Blot檢測α-tubulin蛋白質的表達,發(fā)現低溫脅迫下,野生型煙草的α-tubulin蛋白質表達先升高后下降；而轉基因型煙草中α-tubulin蛋白質表達先降低后升高然后降低再升高。以上結果表明,α-tubulin基因的過量表達提高了轉基因煙草的耐低溫性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S566.1

【參考文獻】

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本文編號：1617433