本文選題：滇龍膽　切入點(diǎn)：3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶　出處：《云南中醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的克隆獲得滇龍膽龍膽苦苷生物合成途徑中可能的三個(gè)關(guān)鍵酶基因:3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、香葉醇-10-羥化酶(G10H)和環(huán)烯醚萜合酶(IS)的c DNA序列,對(duì)三個(gè)基因進(jìn)行原核表達(dá),并分析它們的時(shí)空表達(dá)量與龍膽苦苷積累的關(guān)系。方法從滇龍膽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得HMGR、G10H和IS的轉(zhuǎn)錄本,采用RT-PCR方法獲得三個(gè)基因的全長c DNA序列;利用p EASY-E1/BL21表達(dá)系統(tǒng),對(duì)三個(gè)基因進(jìn)行原核表達(dá);運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析;采用實(shí)時(shí)熒光定量法測定三個(gè)基因在滇龍膽的根、莖、葉中分別于苗期、花期、果期和枯萎期的相對(duì)表達(dá)量;利用超高效液相色譜法測定對(duì)應(yīng)滇龍膽的不同部位于不同生長時(shí)期的龍膽苦苷含量;采用SPSS 20軟件分析三個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)應(yīng)龍膽苦苷含量的相關(guān)性。結(jié)果克隆得到兩條HMGR基因序列,分別命名為GRHMGR-1和GRHMGR-2。GRHMGR-1全長1747bp,ORF為1605bp,編碼534個(gè)氨基酸,GRHMGR-2全長1731bp,ORF為1572bp,編碼523個(gè)氨基酸,兩條序列編碼的蛋白都有著HMGR典型的多肽位點(diǎn)。一條G10H的c DNA序列,全長1400bp,ORF為1248bp,編碼415個(gè)氨基酸,命名為GRG10H,保守區(qū)域分析顯示GRG10H屬于P450家族;一條長1746bp的基因組G10H序列,內(nèi)含子預(yù)測顯示其含三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子。一條全長1388bp的IS基因,ORF為1176bp,共編碼391個(gè)氨基酸,定名為GRIS,保守區(qū)域分析顯示GRIS屬于NADB Rossmann超家族成員。GRHMGR-1、GRHMGR-2、GRG10H和GRIS成功在大腸桿菌中分別表達(dá)出58KDa、56 KDa、48 KDa和44 KDa的目的蛋白。GRHMGR和GRG10H在滇龍膽不同生長時(shí)期的根、莖和葉中都有表達(dá);GRIS只在滇龍膽不同生長時(shí)期的莖和葉中被檢測到表達(dá),根中并沒有檢測到表達(dá)。測定結(jié)果顯示滇龍膽根中的龍膽苦苷含量隨著年限的增長而逐年增長,而莖和葉中的則隨著生長時(shí)期的變化逐漸減少。結(jié)論克隆得到滇龍膽可能的關(guān)鍵酶基因HMGR、G10H和IS并構(gòu)建了原核表達(dá)系統(tǒng),為后期真核表達(dá)系統(tǒng)的建立提供了一定的依據(jù)。GRHMGR、GRG10H和GRIS的表達(dá)量與龍膽苦苷含量積累不具有明顯相關(guān)性。
[Abstract]:Objective to clone the c DNA sequences of three key enzyme genes in the biosynthesis pathway of gentiopicrin from Gentianopicrin: HMGRG, geraniol-10-hydroxylase (G10H) and iridoid synthase (ISS). Three genes were expressed in prokaryotes and the relationship between their spatiotemporal expression and the accumulation of gentiopicrin was analyzed. Methods the transcripts of HMGRG G10H and is were obtained from the transcriptional data of Dian Gentiana, and the full-length c DNA sequences of the three genes were obtained by RT-PCR method. Using p EASY-E1/BL21 expression system, three genes were expressed in prokaryotes, bioinformatics methods were used to analyze the sequence, and real-time fluorescence quantitative method was used to detect the three genes in root, stem and leaf of Gentiana chinensis at seedling stage. The relative expression of gentiopicrin in flowering, fruit and withering stages was determined by ultrahigh performance liquid chromatography (HPLC), and the contents of gentiopicrin in different parts of Dian gentian at different growth stages were determined by ultrahigh performance liquid chromatography. SPSS 20 software was used to analyze the correlation between the relative expression of three genes and the corresponding gentiopicrin content. Results two HMGR genes were cloned and sequenced. GRHMGR-1 and GRHMGR-2.GRHMGR-1 were named as 1 747 BP ORF and 1605 BP, respectively, encoding 534 amino acids GRHMGR-2, encoding 1 572 BP, encoding 523 amino acids. The two sequences encoded proteins with typical polypeptide sites of HMGR. A G10H c DNA sequence with a total length of 1400bp1 ORF was 1248 BP, encoding 415 amino acids. Named GRG10H, the conserved region analysis showed that GRG10H belonged to the P450 family, a 1746bp genome G10H sequence, which was predicted to contain three exons and two introns, and a 1388bp is gene with an ORF of 1176bpencoding 391 amino acids. The conserved region analysis showed that GRIS belongs to the NADB Rossmann superfamily. GRHMGR-2 GRG10H and GRIS successfully expressed the target proteins. GRHMGR and GRG10H of 58K Daji56KDahu48 KDa and 44 KDa in different growth stages of Gentiana yunnanensis, respectively. The expression of GRIS was only detected in stems and leaves of Gentiana chinensis at different growth stages, but not in roots. The results showed that the content of gentiopicrin in the roots of Gentiana davidiana increased year by year with the increase of years. Conclusion the key enzyme genes HMGRG G10H and is were cloned and the prokaryotic expression system was constructed. There was no significant correlation between the expression of GRHMGRGRG10H and GRIS and the accumulation of gentiopicrin.
【學(xué)位授予單位】：云南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S567.239

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本文編號(hào)：1601192