本文選題：NF-κB　切入點(diǎn)：靶基因　出處：《東南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：核因子κB (Nuclear factor kappa B, NF-κB)是一類廣泛存在于多種組織細(xì)胞中的DNA結(jié)合型轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞受到刺激(如TNFa, LPS等誘導(dǎo))時(shí),胞質(zhì)中的NF-κB被激活,進(jìn)入細(xì)胞核,特異性結(jié)合其靶DNA序列,從而調(diào)控其靶基因(包括蛋白編碼基因與miRNA基因)的表達(dá)。大量的研究表明,NF-κB對(duì)靶基因的調(diào)控是其實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能的關(guān)鍵步驟；借此步驟,NF-κB在免疫、炎癥、腫瘤、衰老等重要生理及病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵功能。而且,NF-κB本身及其靶基因還為藥物篩選及疾病治療提供重要靶點(diǎn)。因此,鑒定NF-κB的靶基因具有重要的基礎(chǔ)研究意義和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。本課題對(duì)TNFa誘導(dǎo)的NF-κB靶基因進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定研究,取得如下結(jié)果：1. NF-κB調(diào)控miRNA的表達(dá)為了鑒定NF-κB的靶miRNA.本章首先運(yùn)用高通量技術(shù)(ChIP-Seq和miRNA-Seq)在HeLa細(xì)胞中研究鑒定14個(gè)TNFa誘導(dǎo)的NF-κB靶miRNA,并用ChIP-qPCR和qPCR技術(shù)在TNFa刺激的HeLa和HepG2兩種細(xì)胞中驗(yàn)證此結(jié)果。運(yùn)用miRanda、 miRwalk和DIANA-microT-CDS三款軟件共同預(yù)測出miRNA的576個(gè)靶基因。將這些基因與基因芯片確定的TNFa誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞中的差異表達(dá)基因相比較,鑒定出6個(gè)NF-κB靶miRNA, miR-125b-1-3p, miR-1286、 miR-502-5p、 miR-1276、 miR-219-1-3p和miR-30b-3p的16個(gè)靶基因。最后運(yùn)用qPCR技術(shù)驗(yàn)證了這些miRNA,如miR-125b-1-3p和miR-1276,在HeLa和HepG2細(xì)胞中對(duì)其靶基因的調(diào)控,如miR1276對(duì)CASP9和BMP2基因表達(dá)的調(diào)控。通過DAVID軟件對(duì)基因功能的注釋,發(fā)現(xiàn)BMP2和骨關(guān)節(jié)炎相關(guān),CASP9和2型糖尿病及肺癌相關(guān),提示目前功能尚不清楚的miR-1276可能通過其靶基因BMP2和CASP9在骨關(guān)節(jié)炎、2型糖尿病和肺癌中發(fā)揮作用。進(jìn)一步的分析還表明,miR125b-1除了在HeLa和HepG2細(xì)胞中受TNFa誘導(dǎo)激活的NF-κB的調(diào)控外,還在LPS、IL-1β孢子蟲感染和紫外等多種理化因素刺激的多種類型的其他細(xì)胞中受NF-κB的調(diào)控。此外,該miRNA還能下調(diào)NF-κB活化抑制蛋白TNFAIP3的表達(dá),從而在細(xì)胞內(nèi)形成了一信號(hào)調(diào)控回路。因此,miR125b-1可視為NF-κB通路的“信號(hào)傳遞中心”�？傊�,本章研究結(jié)果為解讀NF-κB在其靶miRNA相關(guān)的生物學(xué)過程中發(fā)揮的生物學(xué)功能提供了新的線索,有助于揭示這些生物學(xué)過程的分子機(jī)制。2. NF-κB調(diào)控凋亡基因CASP9的表達(dá)通�？烧T導(dǎo)的DNA結(jié)合型轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)揮抗凋亡作用。但是,最近越來越多的證據(jù)表明,在特定條件下NF-κB還可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而,介導(dǎo)NF-κB促凋亡作用的靶基因并不完全清楚。在本章中,我們?cè)诜治鯟hIP-Seq數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,運(yùn)用生物信息學(xué)、ChIP-qPCR、雙熒光素酶報(bào)告基因、qPCR和Western blot等方法,證明促凋亡基因CASP9為TNFa誘導(dǎo)NF-κB上調(diào)的靶基因。并在上一章節(jié)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證明,miR1276為TNFa誘導(dǎo)NF-κB下調(diào)的靶miRNA,并且miR1276可下調(diào)CASP9基因的表達(dá)。因此,在NF-κB、 CASP9和miR1276之間,存在著上調(diào)CASP9 表達(dá)的信號(hào)調(diào)控回路。隨后,通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測,發(fā)現(xiàn)TNFa可促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的HeLa和HepG2細(xì)胞的凋亡；并且發(fā)現(xiàn)TNFa不僅誘導(dǎo)此過程中CASP9總蛋白的表達(dá),而且引起CASP9蛋白的激活。此外,CASP9抑制劑可降低TNFa提高的阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。這些結(jié)果表明,TNFa誘導(dǎo)NF-κB上調(diào)并激活的CASP9蛋白,在促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用�？傊�,本章研究發(fā)現(xiàn)NF-κB直接或間接上調(diào)的CASP9基因表達(dá)是NF-κB促凋亡作用的新的介導(dǎo)者,這為洞悉NF-κB的促凋亡功能及其分子機(jī)制提供了新的依據(jù)。3. NF-κB調(diào)控癌癥相關(guān)基因的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn),NF-κB通過調(diào)控其靶基因,在腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等過程中起重要作用。為了充分解讀NF-κB在腫瘤進(jìn)展中的分子功能,在本實(shí)驗(yàn)室曾用ChIP-Seq和基因芯片技術(shù)鑒定了TNFa誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞HeLa中的NF-κB靶基因,本章用基因注釋軟件DAVID進(jìn)一步分析了這些靶基因的功能,發(fā)現(xiàn)20個(gè)靶基因被富集在KEGG的癌癥信號(hào)通路(Pathways in cancer)中,并且其中16個(gè)靶基因被富集在非小細(xì)胞肺癌、慢性粒細(xì)胞性白血病、基底細(xì)胞癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌等癌癥相關(guān)KEGG條目中。因此,這20個(gè)基因被推斷為癌癥相關(guān)的NF-κB靶基因。初步的分析表明,這20個(gè)基因中有些基因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道的NF-κB靶基因。除此之外,本章發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)新的癌癥相關(guān)NF-κB靶基因,如CYCS, MITF, FZD1、 FZD8和PIASl。隨后本章通過生物學(xué)方法、ChIP-qPCR、雙熒光素酶報(bào)告基因、qPCR及Western blot等方法,在HeLa和HepG2細(xì)胞上證實(shí)這5個(gè)基因?yàn)門NFa誘導(dǎo)的NF-κB靶基因。這些研究結(jié)果為深入理解NF-κB在腫瘤演進(jìn)過程中的分子功能奠定了基礎(chǔ)。4. NF-κB調(diào)控三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶基因表達(dá)腫瘤細(xì)胞代謝重編程是腫瘤的基本特征之一。因此,研究代謝相關(guān)的NF-κB靶基因,有助于深入理解該轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤演進(jìn)過程中的分子功能。本章通過分析運(yùn)用ChIP-Seq和基因芯片技術(shù)鑒定的TNFα誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞HeLa中的NF-κB靶基因,發(fā)現(xiàn)在TNFa刺激的HeLa中,編碼三羧酸(Tricarboxylic Acid,TCA)循環(huán)中4個(gè)關(guān)鍵酶的基因(IDH1、IDH3A.ACO2和SUCLA2)的基因區(qū)包含多個(gè)高富集倍數(shù)的NF-κB結(jié)合峰,證明NF-κB結(jié)合這些基因。生物信息學(xué)分析表明,NF-κB結(jié)合峰中包含許多KB位點(diǎn)和顯著類似于經(jīng)典NF-κB結(jié)合模體(motif)的DNA基序。ChIP-qPCR檢測表明,在TNFα刺激的HeLa和HepG2細(xì)胞中,NF-κB確實(shí)結(jié)合這些基因。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果表明,NF-κB對(duì)這些基因的結(jié)合,具有轉(zhuǎn)錄激活此基因的功能。運(yùn)用qPCR和Western blot檢測,進(jìn)一步證明在TNFα誘導(dǎo)的HeLa和HepG2細(xì)胞中,NF-κB可在mRNA和蛋白水平上刺激IDHl,IDH3A和AC02基因的表達(dá)。qPCR和Western blot檢測也表明,NF-κB可在mRNA水平下調(diào)SUCLA2基因的表達(dá),但未改變其蛋白豐度。因此,本章研究將IDHl.IDH3A.AC02和SUCLA2鑒定為TNFα誘導(dǎo)的NF-κB靶基因。這些研究結(jié)果從細(xì)胞的能量代謝角度解析了NF-κB在腫瘤演進(jìn)過程中的分子功能。5. NF-KB調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤基因NBPF的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)NBPF家族基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和靈長類進(jìn)化中發(fā)揮重要功能。但是該家族基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制至今仍未見報(bào)道。本章首先發(fā)現(xiàn)在TNFα刺激的HeLa細(xì)胞內(nèi),NBPF家族基因的基因區(qū)包含大量高富集倍數(shù)的NF-κB結(jié)合峰。而且這些結(jié)合峰中包含許多κB位點(diǎn)。此結(jié)果表明NF-κB結(jié)合NBPF家族基因。qPCR和Westem blot檢測表明,在TNFα誘導(dǎo)的HeLa和HepG2細(xì)胞中,NF-κB調(diào)控NBPF家族基因的表達(dá)。因此,將NBPF家族基因認(rèn)為為TNFα誘導(dǎo)的NF-κB靶基因。此外,生物信息學(xué)分析表明,NBPF蛋白序列上存在經(jīng)典的核定位信號(hào)。Western blot檢測表明,NBPF蛋白在HeLa、 HepG2及ECa109細(xì)胞的核蛋白中均有分布。免疫熒光檢測也表明,NBPF分布于以上三種細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。因此,NBPF為細(xì)胞核分布蛋白。進(jìn)一步的Phyre2軟件分析表明,NBPF家族蛋白N端具有類似經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子STAT1/STAT3B的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域�；谶@些研究結(jié)果,推測細(xì)胞核內(nèi)的NBPF可能具有轉(zhuǎn)錄因子功能。總之,本章研究發(fā)現(xiàn)NBPF為TNFα誘導(dǎo)的NF-κB靶基因,其編碼蛋白可能為DNA結(jié)合型轉(zhuǎn)錄因子。該發(fā)現(xiàn)為充分解讀NF-κB通過NBPF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)展中的分子功能奠定基礎(chǔ)。總之,本論文通過聯(lián)合運(yùn)用高通量技術(shù)、生物信息學(xué)方法和傳統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)等研究技術(shù),鑒定了14個(gè)TNFα誘導(dǎo)的NF-κB靶miRNA,如,miR125b-1和miR-1276.同時(shí)還鑒定出促凋亡基因CASP9、癌癥相關(guān)基因CYCS.MITF.FZD1.FZD8 和PIAS1、TCA循環(huán)關(guān)鍵酶基因IDHl.IDH3A.ACO2和SUCLA2,以及NBPF家族基因?yàn)門NFα誘導(dǎo)的NF-κB靶基因。這些研究結(jié)果豐富了NF-κB的靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步解讀了NF-κB在腫瘤等重大疾病進(jìn)展中的分子生物學(xué)功能及其作用機(jī)理,為NF-κB的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了新的依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R3416

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Caspase Family Proteases and Apoptosis[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年11期

2 何太平,莫麗兒,梁念慈;斑蝥素抑制人高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM侵襲轉(zhuǎn)移的體外實(shí)驗(yàn)研究[J];癌癥;2005年04期

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本文編號(hào)：1600668