發(fā)布時(shí)間：2018-03-09 09:16

  本文選題：玉米大斑病菌　切入點(diǎn)：6-磷酸海藻糖合成酶　出處：《沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：玉米大斑病作為一種重要的玉米葉部病害,近幾年在東北地區(qū)呈流行高發(fā)態(tài)勢(shì),對(duì)玉米的產(chǎn)量造成了重大損失。長(zhǎng)期以來(lái),人們對(duì)玉米大斑病菌的致病機(jī)制研究不夠深入,限制了新型防治技術(shù)的開(kāi)發(fā),深入探索玉米大斑病致病機(jī)制對(duì)防治其發(fā)生及流行有重要意義。6-磷酸海藻糖合成酶TTST(Trehalose-6-phosphate synthase 1)在稻瘟菌具有調(diào)控菌絲生長(zhǎng)與致病力的作用,但玉米大斑病菌StTPS1基因的功能尚未報(bào)道。本研究建立了玉米大斑病菌基因敲除技術(shù)體系,采用基因敲除技術(shù)驗(yàn)證StTPS1基因的功能,并闡明StTPS1基因在玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮的作用,進(jìn)一步深入探討玉米大斑病菌致病力形成的分子機(jī)制。1.利用PCR擴(kuò)增方法克隆了玉米大斑病菌StTPS1基因。參照稻瘟菌MgTPS1氨基酸序列,采用同源比對(duì)的方法找出玉米大斑病菌中StTPS1的同源蛋白,利用PCR擴(kuò)增方法成功克隆了玉米大斑病菌基因組中對(duì)應(yīng)的同源基因,并命名為StTPS1。該基因全長(zhǎng)為2090 bp,包含四個(gè)外顯子與三個(gè)內(nèi)含子,兩端具有非翻譯區(qū)。根據(jù)該基因編碼蛋白質(zhì)的序列與稻瘟菌中MgTPS1基因編碼蛋白質(zhì)的序列之間的高度同源性,可以確定該基可能為玉米大斑病菌中的6-磷酸海藻糖合成酶StTPS1基因。2.采用多種生物信息學(xué)分析方法對(duì)StTPS1基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行了深入地分析,明確了其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息。分析結(jié)果表明:該基因編碼517個(gè)氨基酸、相對(duì)分子質(zhì)量為58376.29、理論等電點(diǎn)為5.36并且屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)與親水性蛋白質(zhì)。軟件分析表明該基因編碼蛋白質(zhì)中不含有信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu),亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果分析此蛋白定位于細(xì)胞質(zhì),含有可被磷酸化的位點(diǎn)暗示該蛋白可被激酶磷酸化發(fā)揮作用,不存在糖基化位點(diǎn)。結(jié)構(gòu)域分析表明,該蛋白含有糖苷水解酶家族的結(jié)構(gòu)域,這與稻瘟菌MgTPS1的分析結(jié)果相似。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示,玉米大斑病菌分類地位與稻瘟菌較為接近,表明兩者的同源性較高,進(jìn)化關(guān)系較近。因此,推斷StTPS1基因與稻瘟菌中TPS1基因功能相似,可能具有代謝調(diào)控與引起致病力的作用。3.對(duì)玉米大斑病菌StTPS1基因敲除載體進(jìn)行構(gòu)建。以pBlueScript克隆載體為基礎(chǔ),將pSilent-1載體中的潮霉素抗性基因經(jīng)PCR擴(kuò)增、HindⅢSmaI雙酶切后再連接至pBlueScript載體中獲得基因敲除骨架載體pBS-HPH。使用高保真酶擴(kuò)增StTPS1基因上游片段1125 bp和下游片段895 bp分別克隆至基因敲除骨架載體pBS-HPH中,成功構(gòu)建StTPS1基因敲除載體pBS-StTSS1。4.建立了玉米大斑病菌的遺傳化體系和基因敲除體系,獲得了疑似玉米大斑病菌StTPS1基因敲除突變體。通過(guò)對(duì)玉米大斑病菌產(chǎn)孢條件優(yōu)化,確定了玉米大斑病菌在燕麥瓊脂培養(yǎng)基和V8蔬菜汁固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)、23℃全黑暗條件下培養(yǎng)14 d時(shí)產(chǎn)孢量較多。驗(yàn)證出兩種分生孢子的收集的最適方法分別為:吸頭刮取方法和震蕩培養(yǎng)基法。確定了溶壁酶、崩潰酶和蝸牛酶三種酶在酶解時(shí)的比例為1:1:1,在28℃ 80rpm下酶解時(shí)間為3至5 h時(shí)可釋放原生質(zhì)體數(shù)量達(dá)到最大。進(jìn)一步優(yōu)化了轉(zhuǎn)化方法,經(jīng)過(guò)多次的實(shí)驗(yàn)獲得疑似玉米大斑病菌StTPS1基因敲除突變體。在進(jìn)一步驗(yàn)證敲除菌株的準(zhǔn)確性及其致病力的變化。5.對(duì)玉米大斑病侵染過(guò)程中玉米抗性的響應(yīng)進(jìn)行了研究。接種玉米大斑病菌菌株SYY1303至感病玉米品種黃早四后,在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集葉片,利用前人報(bào)道的方法對(duì)四種防御關(guān)鍵酶的活性進(jìn)行了分析。結(jié)果證實(shí),接種后防御酶的活性均顯著上升,但苯丙氨酸解氨酶的活性是先下降而后上升,與其它種類植物受到病原菌侵染后自身防御酶活性變化的趨勢(shì)相一致。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S435.131.4

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1 邢繼紅;董金皋;;玉米大斑病菌菌絲蛋白單克隆抗體制備[J];植物病理學(xué)報(bào);2006年02期

2 劉振盼;王艷輝;董金皋;;玉米大斑病菌完整染色體DNA的制備方法[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2007年06期

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本文編號(hào)：1587911