發(fā)布時(shí)間：2018-03-07 21:29

  本文選題：folliculin(FLCN)　切入點(diǎn)：亮氨酸　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：BHD(Birt-Hogg-Dubé)綜合征是一種由抑癌基因folliculin(FLCN)突變引起的遺傳疾病,其臨床癥狀主要包括良性皮膚腫瘤、自發(fā)性氣胸、肺部囊腫等,嚴(yán)重時(shí)某些患者發(fā)生腎癌。然而FLCN的生物學(xué)功能至今仍未完全闡明。在前期工作中,作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了一種BHD的果蠅動(dòng)物模型。利用該模型發(fā)現(xiàn),敲除FLCN基因與mTOR信號(hào)通路被抑制的表型相似;更重要的是,在培養(yǎng)基中添加高濃度的亮氨酸(Leu)可以顯著挽救FLCN突變的表型。該研究表明,果蠅的FLCN基因與亮氨酸誘導(dǎo)的mTOR信號(hào)通路關(guān)系密切。然而其具體的分子機(jī)理,以及在哺乳動(dòng)物中是否存在相似的機(jī)制還有待研究。為了闡明以上科學(xué)問題,本研究以人胚腎細(xì)胞系HEK293為模型,深入探究了人FLCN在亮氨酸誘導(dǎo)的mTORC1信號(hào)通路中的作用機(jī)制,獲得了如下主要結(jié)果:1.抑制FLCN的表達(dá)降低m TORC1活性;添加高濃度的亮氨酸阻止mTORC1活性降低。通過RNA干擾(RNAi)方法抑制FLCN的表達(dá),m TORC1的活性降低;進(jìn)一步在培養(yǎng)基中添加高濃度的亮氨酸可以顯著提高mTORC1活性。2.FLCN能夠降低mTORC1對(duì)于亮氨酸信號(hào)的敏感度。在完全培養(yǎng)基中,添加高濃度的亮氨酸不能使對(duì)照細(xì)胞的m TORC1活性進(jìn)一步升高,這說明mTORC1已被完全激活;在FLCN表達(dá)被抑制的細(xì)胞中,mTORC1的活性隨著培養(yǎng)基中亮氨酸水平的升高而不斷升高,直至達(dá)到在相同培養(yǎng)條件下與對(duì)照細(xì)胞中相似的水平。3.FLCN定位于溶酶體,其在溶酶體上的富集度受胞內(nèi)氨基酸濃度影響。免疫熒光以及western blot試驗(yàn)表明,在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,只有少部分FLCN蛋白定位在溶酶體上;在氨基酸缺乏的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí),有更多的FLCN蛋白定位于溶酶體。4.FLCN維持溶酶體內(nèi)的亮氨酸水平�，F(xiàn)有證據(jù)表明,溶酶體內(nèi)的氨基酸,尤其是亮氨酸,是激活mTORC1的直接信號(hào)。當(dāng)FLCN表達(dá)被抑制,或者當(dāng)環(huán)境中氨基酸缺乏時(shí),溶酶體內(nèi)的亮氨酸濃度顯著降低;反之,過表達(dá)FLCN使得細(xì)胞即使在氨基酸缺乏的情況下,仍然能夠維持較高濃度的溶酶體內(nèi)的亮氨酸水平。5.FLCN能夠拮抗跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PAT1的功能,實(shí)現(xiàn)對(duì)mTORC1信號(hào)的調(diào)控。研究表明,氨基酸缺乏能引起mTORC1活性降低,抑制PAT1表達(dá)可以部分恢復(fù)m TORC1的活性,而同時(shí)抑制FLCN表達(dá)后,m TORC1活性再次被抑制。6.FLCN抑制PAT1在溶酶體上的分布。在正常培養(yǎng)條件下,有部分PAT1蛋白定位于溶酶體;氨基酸缺乏,或者抑制FLCN的表達(dá)能夠促進(jìn)PAT1富集在溶酶體上;而過表達(dá)FLCN則會(huì)阻止PAT1在溶酶體上的募集。7.FLCN與PAT1存在緊密的相互作用。免疫熒光試驗(yàn)表明,FLCN與PAT1在細(xì)胞內(nèi)有共定位;免疫共沉淀試驗(yàn)進(jìn)一步表明,FLCN與PAT1存在蛋白與蛋白之間的相互作用。根據(jù)以上結(jié)果,我們得出以下兩個(gè)主要結(jié)論。一,FLCN通過維持溶酶體內(nèi)亮氨酸濃度來激活m TORC1;二,FLCN通過抑制PAT1定位于溶酶體實(shí)現(xiàn)其對(duì)于溶酶體內(nèi)亮氨酸濃度的調(diào)控。本項(xiàng)研究不但發(fā)現(xiàn)了FLCN調(diào)控溶酶體內(nèi)氨基酸濃度的一個(gè)新功能,同時(shí)也揭示出對(duì)于溶酶體內(nèi)亮氨酸信號(hào)水平的調(diào)控是一種新的mTORC1調(diào)控方式。
[Abstract]:BHD (Birt-Hogg-Dub) syndrome is a tumor suppressor gene folliculin (FLCN) genetic disease caused by a mutation, the clinical symptoms mainly include benign skin tumor, spontaneous pneumothorax, pulmonary cyst, severe renal carcinoma in some patients. However, the biological function of FLCN has not been completely elucidated. In previous work, the author a lab flies a BHD animal model. Using this model, found that the knockout phenotype of FLCN gene and mTOR signaling pathway was inhibited by similar; more importantly, in the cultivation of high concentration medium supplemented with leucine (Leu) can significantly save the phenotype of FLCN mutant. The study showed that mTOR signaling pathway FLCN the Drosophila gene and leucine induced closely. However, its molecular mechanism, and whether in mammals have similar mechanism remains to be studied. In order to clarify the above science problem, this study In human embryonic kidney cell line HEK293 as a model, the in-depth study of the mechanism of FLCN in mTORC1 signaling pathway induced by leucine in, obtained the results as follows: 1. the inhibition of expression of FLCN m decreased TORC1 activity; adding high concentrations of leucine blocking mTORC1 activity decreased. By RNA interference (RNAi) suppression of FLCN expression method m, reduce the activity of TORC1; further adding high concentration of leucine in the medium can significantly increase the activity of mTORC1.2.FLCN can reduce the mTORC1 signal for leucine sensitivity. Cultured in complete medium, adding high concentration of leucine can control cells m TORC1 activity increased further, which indicates that mTORC1 has been fully activated the expression of FLCN was inhibited; in cells, mTORC1 activity increased continuously with increasing culture medium and leucine levels, until it reaches under the same culture conditions and control cells. Like the level of.3.FLCN localized in lysosomes, the lysosome enrichment by intracellular amino acid concentrations. Immunofluorescence and Western showed that blot test, in vitro cultured in complete medium, only a small part of FLCN protein is localized in lysosomes; nutrient medium in amino acid deficiency training, FLCN protein localization more in the lysosome.4.FLCN maintain intralysosomal leucine levels. The available evidence suggests that the intralysosomal amino acids, especially leucine, is a direct signal to activate mTORC1. When FLCN expression was inhibited, or when the environment of amino acid deficiency, leucine concentration of lysosomes decreased significantly; conversely, overexpression of FLCN the cells even in the absence of amino acids, can still maintain a high concentration of intralysosomal leucine levels.5.FLCN can antagonize the transmembrane amino acid transporter PAT1 function, the realization of mTOR The regulation of C1 signal. The results show that amino acid deficiency can cause the decrease of mTORC1 activity, inhibit the expression of PAT1 m TORC1 activity can be partially recovered, while inhibiting the expression of FLCN, the distribution of M TORC1 activity was again.6.FLCN suppression on PAT1 in lysosomes. Under normal culture conditions, some of the PAT1 protein localized in lysosomes amino acid; lack or inhibit the expression of FLCN can promote PAT1 accumulation in lysosomes; the interaction between.7.FLCN and PAT1 close to raise and over expression of FLCN will prevent PAT1 in lysosomes. The immunofluorescence experiments indicate that FLCN colocalized with PAT1 in cells; CO immunoprecipitation experiments further indicate that the interaction between. Between protein and protein FLCN and PAT1. According to the above results, we draw the following two conclusions. First, the FLCN solution by maintaining the leucine concentration in vivo enzyme to activate the m TORC1; two, FLCN After inhibition of PAT1 localized in lysosomes to achieve its regulation of soluble leucine concentration in vivo enzyme. This study not only found a new function of FLCN solution concentration of amino acids in the regulation of the enzyme, but also reveals the regulation of lysosomal leucine signal level is a new kind of mTORC1 control mode.

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R596

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本文編號(hào)：1581030