本文選題：夏枯草　切入點：迷迭香酸　出處：《中國科學(xué)院教育部水土保持與生態(tài)環(huán)境研究中心》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：夏枯草(Prunella vulgaris L.)為多年生唇形科夏枯草屬植物,因“夏至后即枯”而得名。其以干燥的果穗入藥,系我國傳統(tǒng)大宗藥材之一,味辛、苦,性寒,歸肝、膽經(jīng),主要成分有迷迭香酸、咖啡酸、熊果酸、齊墩果酸、黃酮類物質(zhì)、矢車菊素、揮發(fā)油等,具有緩解咽喉腫痛、清熱明目、加速傷口愈合等作用。2015版《中國藥典》規(guī)定夏枯草以干燥品計算,迷迭香酸含量不得低于0.2%。目前,對于夏枯草中迷迭香酸生物合成途徑的酶的信息知之甚少,故對夏枯草迷迭香酸代謝途徑酪氨酸支路關(guān)鍵酶基因進行克隆和功能驗證,并進一步利用植物代謝工程的手段來提高夏枯草中迷迭香酸的含量,具有極為重要的理論和現(xiàn)實意義。本文主要采用同源克隆的方法克隆了夏枯草迷迭香酸生物合成途徑酪氨酸支路上的酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因(PvTAT,KM053278)和對羥基苯丙酮酸還原酶基因(PvHPPR,KM053279),在分析其生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上,從組織表達分析和誘導(dǎo)子誘導(dǎo)分析、蛋白的亞細胞定位、原核蛋白表達及體外酶動力學(xué)活性檢測、體內(nèi)酶功能互補、過表達和反義表達目的基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因毛狀根方面著手,確定其體內(nèi)和體外酶活活性,進而解析轉(zhuǎn)基因毛狀根株系中基因表達量、酶活、迷迭香酸含量三者之間的關(guān)系,最終闡明該酶在夏枯草迷迭香酸合成途徑中的作用,得到主要結(jié)果如下:1.PvTAT的開放閱讀框序列長1,236-bp,編碼411個氨基酸,預(yù)測分子量45.1 kDa,等電點5.97;基因組序列長2,634-bp,含有7個外顯子,6個內(nèi)含子。PvTAT保守結(jié)構(gòu)域具有典型的酪氨酸催化位點和PLP結(jié)合位點,歸屬于PLP依賴的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶超家族,依據(jù)Panther classification system歸類系統(tǒng),其亦屬于酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶亞家族。PvHPPR的開放閱讀框序列長942-bp,編碼313個氨基酸,預(yù)測分子量34.1 kDa,等電點5.58;基因組序列有兩個,分別長2,215-bp和1,718-bp,兩者均含有2個外顯子和1個內(nèi)含子,大片段的內(nèi)含子序列比小片段的多了497-bp�；蚪M步移得到其上游序列2,273-bp,啟動子序列中含有響應(yīng)光、水楊酸、環(huán)境脅迫、調(diào)控生長發(fā)育和初生代謝有關(guān)的作用元件。PvHPPR保守結(jié)構(gòu)域具有典型的NAD(P)H結(jié)合區(qū)域和精氨酸、谷氨酸、組氨酸催化位點,歸屬于2-羥基酸脫氫酶家族。2.qRT-PCR表明PvTAT和PvHPPR在盛花時期根中的相對表達量最高,葉中次之,兩者的表達均受外源的水楊酸和乙烯信號的調(diào)節(jié)。3.通過在PvTAT和PvHPPR的C-端融合GFP蛋白,將其在煙草中瞬時表達,用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草的原生質(zhì)體發(fā)現(xiàn)PvTAT定位在細胞質(zhì)中;觀察煙草葉片發(fā)現(xiàn)PvHPPR與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)marker共定位,PvHPPR定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。4.PvTAT能夠功能互補酪氨酸營養(yǎng)缺失突變體大腸桿菌DL39,使其恢復(fù)生長;原核表達PvTAT,重組蛋白的分子量~65 kDa,體外酶活測定表明,PvTAT具有酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性,并且正向反應(yīng)比反向反應(yīng)的酶活活性更高,對酪氨酸和苯丙酮酸的親和性最高,Km值分別是0.40 mM和0.48 mM。原核表達PvHPPR,重組蛋白PvHPPR的分子量~47 kDa,體外酶活測定表明,PvHPPR具有使4-羥基苯丙酮酸、苯丙酮酸、丙酮酸還原成相應(yīng)的乳酸鹽的能力,NADH和NADPH均可作為其輔因子,對NADPH的親和性更高;對4-羥基苯丙酮酸的親和性比對苯丙酮酸與丙酮酸的親和性要高,對應(yīng)的Km值分別是0.31、0.73、1.02 mM。5.在夏枯草毛狀根中分別過表達和反義表達PvTAT,反義表達PvTAT使其表達量降低了46 95%,酶活隨之降低,迷迭香酸的含量降低了36 91%;相反,過表達PvTAT使其表達量升高了0.77 2.6倍,酶活隨之升高,迷迭香酸的含量升高了1.3 1.8倍。相關(guān)性分析結(jié)果顯示:夏枯草毛狀根中PvTAT的表達量、TAT的活性、迷迭香酸的含量三者間存在顯著的正相關(guān)性,表明該酶參與夏枯草中迷迭香酸的生物合成。在夏枯草毛狀根中過表達PvHPPR,使其表達量升高了0.7 9.7倍,迷迭香酸的含量升高了24 63%。相關(guān)性分析結(jié)果顯示:夏枯草毛狀根中PvHPPR的表達量與迷迭香酸的含量存在顯著的正相關(guān)性,表明該酶參與夏枯草中迷迭香酸的生物合成。6.獲得了迷迭香酸含量較高的毛狀根株系,迷迭香酸含量比原植物中高了近10 30倍。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院教育部水土保持與生態(tài)環(huán)境研究中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S567.239

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本文編號：1577479