本文選題：甲真菌病　切入點：幾丁質合酶　出處：《安徽醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：甲真菌病(Onychomycosis)是指由皮膚癬菌、酵母菌和條件致病霉菌侵犯甲板和(或)甲下組織引起的一類疾病。國內(nèi)患病率高,具有一定的傳染性,臨床治療困難且系統(tǒng)抗真菌治療費用高、有一定的副作用。目前甲真菌病的發(fā)病機制尚未完全清楚。真菌細胞壁幾丁質的合成是一個復雜的過程,其關鍵酶為幾丁質合酶(chitin synthnase,CHS)。在不同的真菌中存在著一種至多種類別的CHS同工酶。這些同工酶在維持細胞壁完整性,菌絲正常生長和無性孢子產(chǎn)生等方面起著重要的作用。在致病真菌中還發(fā)現(xiàn)一些CHS基因的缺失會使菌株的生長速率和感染能力同時減弱。由于在動物和植物中不存在幾丁質,因此CHS被認為是抗真菌藥物的理想靶標。本課題擬選取甲真菌病中最常見的皮膚癬菌致病菌紅色毛癬菌,通過建立紅色毛癬菌感染甲板的甲真菌病體外模型,采用實時熒光定量PCR技術檢測紅色毛癬菌幾丁質合酶CHS1 mRNA和CHS2 mRNA的表達情況,探討CHS在真菌感染甲板中的作用,為研究真菌CHS作為抗真菌藥物有效靶標及其抑制劑提供參考,且能更好地理解甲真菌病的發(fā)病機制,更有效地指導新型抗真菌藥物的研制與開發(fā),進一步指導臨床相關治療。方法：1、采用豬甲板構建紅色毛癬菌感染的甲真菌病體外模型。2、運用實時熒光定量PCR技術建立幾丁質合酶(CHS2 mRNA)的標準品和標準曲線。3、采用上述構建的標準品檢測不同時間點(1、2、3、4、5周)紅色毛癬菌感染豬甲板后幾丁質合酶(CHS1 mRNA、CHS2 mRNA)的表達水平。結果：1、采用豬甲板構建紅色毛癬菌感染的甲真菌病體外模型,密封性較好,易于觀察紅色毛癬菌不同時間點穿透甲板的大體形態(tài)。2、相對定量PCR構建幾丁質合酶(CHS2 mRNA)的標準品和標準曲線,檢測結果顯示Total RNA反轉錄得到的cDNA作為標準品可以得到較好的擴增曲線、熔解曲線和標準曲線,標準曲線顯示線性關系良好(管家基因GAPDH:R2=0.999,目的基因CHS2:R2=0.999R20.98),可以在寬廣的范圍內(nèi)進行準確定量；擴增效率較好(管家基因GAPDH:E=89.18%,目的基因CHS2：E=96.08%,0.8E1.2)。3、與對照組相比,實驗組紅色毛癬菌CHS1 mRNA表達在1周前無明顯變化(P0.05),但在2周后表達明顯增加(P0.05),而CHS2 mRNA在各時間點表達均明顯增加(P0.05)。結論：1、甲真菌病體外模型構建良好,經(jīng)濟可行,適用于評估真菌對甲板的致病作用。2、相對定量方法構建的目的基因CHS2與管家基因GAPDH標準曲線呈現(xiàn)良好的線性關系和重復性3、從熒光定量PCR檢測目的基因(CHS1 mRNA、CHS2 mRNA)的相對值可以看出,實驗組與對照組存在明顯差異(P0.05),說明幾丁質合酶在紅色毛癬菌感染甲板的過程中對甲的致病有重要的作用。
[Abstract]:Objective: Onychomycosisis is a class of diseases caused by dermatophytes, yeasts and opportunistic fungi invading decks and / or subarachnoid tissues. Clinical treatment is difficult and systemic antifungal therapy is expensive and has some side effects. At present, the pathogenesis of onychomycosis is not completely clear. The synthesis of chitin in fungal cell wall is a complicated process. Its key enzyme is chitin synthysm CHS. There is one or more classes of CHS isozymes in different fungi. These isozymes maintain cell wall integrity. Hyphal normal growth and asexual spore production play an important role. In pathogenic fungi, it was also found that the absence of some CHS genes weakens both the growth rate and infection ability of the strain, since chitin does not exist in animals and plants. Therefore, CHS is considered to be an ideal target for antifungal drugs. In this study, the most common dermatophytes, Trichophyton rubrum, which is the most common pathogen in onychomycosis, was selected to establish an in vitro model of onychomycosis on the infection deck of Trichophyton rubrum. The expression of chitinase CHS1 mRNA and CHS2 mRNA in Trichophyton rubrum was detected by real-time fluorescence quantitative PCR technique, and the role of CHS in fungal infection deck was discussed, which provided a reference for the study of fungal CHS as an effective target of antifungal drugs and its inhibitor. And it can better understand the pathogenesis of onychomycosis and guide the research and development of new antifungal drugs more effectively. Methods: 1 was used to construct an in vitro model of onychomycosis infected by Trichophyton rubrum, and real-time fluorescence quantitative PCR was used to establish the standard product and standard curve of chitinase CHS2 mRNA.3. The expression level of chitin synthase CHS1 mRNA-CHS2 mRNAs at different time points was detected at different time points. Results: the in vitro model of onychomycosis infected by Trichophyton rubrum was constructed. It is easy to observe the gross shape of Trichophyton rubrum through deck at different time points. The relative quantitative PCR was used to construct the standard product and standard curve of chitinase ChS 2 mRNAs. The results showed that cDNA obtained by reverse transcription of Total RNA could obtain better amplification curve, melting curve and standard curve. The standard curve showed a good linear relationship (GAPDH: R2N 0.999, target gene CHS2: R2O0.999R20.98), which could be accurately quantified in a wide range, and had a better amplification efficiency (GAPDH: E96.080.8E1.2N. 3, compared with the control group), the standard curve showed a good linear relationship (GAPDH: R2N 0.999, CHS2: R2O0.999R20.98), and the amplification efficiency was better (GAPDH: E96.080.8E1.2k.3.Compared with the control group. The expression of CHS1 mRNA of Trichophyton rubrum in the experimental group did not change significantly before 1 week, but increased significantly after 2 weeks, while the expression of CHS2 mRNA increased significantly at each time point. Conclusion: 1: 1, the in vitro model of onychomycosis is well constructed and feasible. It can be used to evaluate the pathogenicity of fungi on deck. 2. The standard curve of target gene CHS2 and housekeeper gene GAPDH is linear and reproducible 3. The detection of target gene CHS1 mRNA-CHS2 mRNAs from fluorescent quantitative PCR). As you can see from the relative value, There was a significant difference between the experimental group and the control group, indicating that chitin synthase plays an important role in the process of infection deck of Trichophyton rubrum.
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R756

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