本文選題：糖基轉移酶　切入點：UGT72B1　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：細胞的木質化主要是木質素在細胞壁內沉淀的過程。正常情況下,該過程主要發(fā)生于維管束的次生木質部,進而增加木質部細胞壁硬度和機械支撐力。木質素的累積還能增強植物體長距離水分運輸能力以及抵御機械損傷和病原菌微生物的侵害等。細胞木質化的生理學過程既是一個代謝問題,又是一個發(fā)育問題。由于調節(jié)細胞木質化的基因數(shù)量眾多,機制復雜,目前了解很少。因此,深入研究細胞木質化的調控機理,不僅對于理解植物生長發(fā)育的規(guī)律有重要的科學理論意義,而且對于農作物改良以及樹木材質改良具有潛在的應用價值。植物體內普遍存在木質素單體的糖基化修飾現(xiàn)象,然而該現(xiàn)象從上個世紀六七十年代發(fā)現(xiàn)以來,一直沒有研究清楚木質素單體糖基化是否與木質素合成之間存在關系。為了深入理解它們之間的關系以及探索糖基化修飾在木質素代謝以及細胞木質化過程中的作用機制,我們圍繞糖基轉移酶UGT72B1開展了一系列的研究工作,取得了重要進展。1. ugt72b1突變體鑒定與表型分析本研究首先篩選鑒定出了UGT72B1兩個擬南芥T-DNA插入突變體ugt72b1ko-1 (SALK_049597)和ugt72b1ko-2 (SAIL_611_E04)的純合株系,發(fā)現(xiàn)它們有相同的表型：一方面莖尖有大量花青素積累,另一方面莖尖生長受到嚴重抑制。將UGT72B1基因導入到突變體后表型能完全恢復到野生型狀態(tài),說明突變體表型確實是由UGT72B1功能缺失導致。我們對莖段橫切面進行木質素特異性染色,不論是Wiesner染色還是Maule染色,結果都表明突變體出現(xiàn)了嚴重的異位木質化和細胞壁木質化的增強。木質素含量分析表明突變體的木質素含量比野生型顯著增加。透射電鏡觀察細胞壁厚度發(fā)現(xiàn)突變體細胞壁厚度明顯增厚。以上結果表明UGT72B1參與了細胞壁的木質化過程,它的功能缺失會導致細胞壁異位木質化和增強的木質化,并影響植物的生長發(fā)育。2. UGT72B1底物篩選及生化分析鑒定構建了UGT72B1的原核表達載體,經表達和純化獲得了重組蛋白,利用體外酶促反應并借助HPLC-MS技術,我們對激素類物質如生長素和赤霉素等以及苯丙烷類物質如木質素前體和黃酮類物質等進行了篩選,鑒定出這個糖基轉移酶能夠糖基化松柏醇、二氫松柏醇、對羥基肉桂醇和松柏醛等木質素前體。同時我們檢測i7GT72B1高表達體內松柏苷含量,發(fā)現(xiàn)明顯高于野生型和恢復系。對UGT72B1酶促動力學常數(shù)測定,發(fā)現(xiàn)UGT72B1對松柏醇的活性最高,比酶活為6.6 nkat/mg, Kcat/Km為0.74 mM-1s-1,高于對松柏醛的催化效率(3.1 nkat/mg和0.30 mmM-1S-1)。同時我們也對UGT72B1的同源基因UGT72B2和UGT72B3進行了原核表達的蛋白純化和底物篩選,發(fā)現(xiàn)UGT72B3能夠糖基化芥子醛和松柏醛,但沒有發(fā)現(xiàn)UGT72B2對木質素前體的酶活性。將UGT72B2和iJGT72B3在ugt72bl突變體內組成型過表達,發(fā)現(xiàn)UGT72B3能夠恢復ugt72bl的表型,而UGT72B2不能恢復。以上結果表明UGT72B1能夠糖基化木質素前體,。同時也表明UGT72B1與UGT72B3在生化活性上有一定的相似性。3.基因的表達模式分析構建了JGT72B1啟動子驅動的GUS基因表達系統(tǒng),對GUS活性的組織化學染色表明：幼苗期,UGT72B1在莖生長點及新生葉葉脈的連接處有較強表達；抽薹以后,主要在幼嫩莖尖、幼嫩莖生葉的葉脈、花序柄以及花瓣的維管組織中表達。從莖的橫切面染色來看,UGT72B1在幼嫩莖的各個組織都有表達,如木質部、髓部和表皮,但是在稍微老點的莖中只在木質部表達。另外通過qRT-PCR也對表達模式進行了分析,結果顯示UGT72B1在各個組織的表達模式與GUS組織化學染色結果基本一致,其中主要在幼嫩的莖中表達。同時利用GUS染色和qRT-PCR技術分析了UGT72B2, UGT72B3與UGT72E2基因的表達模式,發(fā)現(xiàn)UGT72B2主要在葉片的葉脈上表達；UGT72B3主要在葉柄的基部有較強表達,在幼嫩葉片葉邊緣的出水孔處有很強的表達,導管處也有微量表達。UGT72E2主要在苗期表達,在根和莖中只有少量表達。檢測了ugt72bl突變體背景下UGT72B3與UGT72E2的表達量變化,發(fā)現(xiàn)二者的表達量都有所提高。以上結果表明UGT72B1表達部位正好與突變體產生表型的部位向吻合。幾個進化關系很近的糖基轉移酶表達模式各不相同,都有自己的表達部位偏好性,可能與它們發(fā)揮的主要作用相關。4.突變體轉錄組及qRT-PCR分析qRT-PCR檢測木質素合成相關基因(包括前體合成、前體運輸、前體聚合和相關轉錄因子)在突變體中的表達情況,發(fā)現(xiàn)木質素前體合成相關基因CCR、 COMT、HCT、CAD、4CL、C4H、 CCOATOT和PAL都有明顯的上調表達；前體運輸及聚合相關基因ABCG、RBOH、 PRX和LAC上調表達也比較明顯；木質素合成相關轉錄因子基因MYB58、 MYB61、MYB63和MYB643以及NAC家族成員NST1和NST3表達量也顯著上調。另外我們還檢測到花青素合成通路中的DFR及黃酮合成通路中的CHS上調表達比較顯著。這些結果說明在突變體中涉及木質素單體以及木質素合成的整個代謝都獲得了增強。為了更加全面了解轉錄組的變化,對突變體進行了轉錄組分析。結果發(fā)現(xiàn)突變體中共有931個基因的表達發(fā)生了顯著變化,其中有705個上調顯著,226個下調顯著。差異表達的基因主要集中在苯丙烷代謝途徑、黃酮合成途徑、植物病原體互作途徑、淀粉和糖代謝途徑、以及苯丙氨酸代謝途徑。但是只有苯丙烷-木質素代謝途徑中幾乎每一步的基因都顯示上調表達,這與qRT-PCR分析的結果是一致的。以上結果表明突變體中UGT72B1的功能缺失激活了苯丙烷-木質素合成途徑上的相關基因,甚至苯丙烷代謝分支途徑里的基因也被激活,結果導致細胞壁嚴重的異位木質耗和木質化程度的增強,并且伴有花青素積累和莖生長發(fā)育受阻。總之,本論文的結果不僅增加了對植物糖基轉移酶家族的功能理解,而且首次證明木質素單體的糖基化修飾參與調節(jié)細胞壁木質素的合成過程,回答了近半個世紀以來懸而未決的科學問題,為研究糖基化修飾在木質素代謝以及細胞木質化過程中的作用機制提供了重要的突破口,為深入而且全面理解木質素合成以及細胞壁木質化的分子機制奠定了新的理論基礎。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

【參考文獻】

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1 Jun Shigeto;Yoshitaka Itoh;Sakie Hirao;Kaori Ohira;Koki Fujita;Yuji Tsutsumi;;Simultaneously disrupting AtPrx2,AtPrx25 and AtPrx71 alters lignin content and structure in Arabidopsis stem[J];Journal of Integrative Plant Biology;2015年04期

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本文編號：1557931