本文關(guān)鍵詞： 細(xì)胞自噬 兒童急性白血病 LC3-Ⅱ P62 免疫組織化學(xué) RT-PCR　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:細(xì)胞自噬是所有真核生物共有的一種保守的代謝途徑,微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)及自噬降解底物P62蛋白在細(xì)胞自噬過程中起重要作用,本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)LC3-Ⅱ及P62蛋白及基因在初診未治急性白血病兒童骨髓細(xì)胞中的表達(dá)程度了解急性白血病兒童骨髓細(xì)胞中細(xì)胞自噬的表達(dá)水平的高低,為從新的角度解釋兒童急性白血病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù),為兒童急性白血病的治療提供新思路。方法:1免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(Immunohistochemical streptavidin Perosidase)1.1病例及分組隨機(jī)選取2014年1月至2016年6月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院兒科住院確診的初診未治急性白血病(acute leukemia,AL)患兒50例作為實(shí)驗(yàn)組,其中急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)30例,包括標(biāo)危13例,中危14例,高危3例,B型ALL24例,T型ALL6例;急性髓細(xì)胞性白血病(acute myelocytic leukemia,AML)20例,其中包括M1 1例,M2 5例,M3 5例,M4 4例,M5 3例,M7 2例;所有AL病例中性別組成為男孩30例,女孩20例,年齡1歲~14歲;所有患兒均經(jīng)臨床表現(xiàn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)(Morphology,M)、免疫學(xué)(Immunology,I)、細(xì)胞遺傳學(xué)(Cytogentics,C)和分子生物學(xué)(Molecular,M)分型(MICM)確診,同時(shí)隨機(jī)選取性別和年齡與實(shí)驗(yàn)組相匹配的非惡性血液病患兒20例(其中包括免疫性血小板減少癥患兒14例,營(yíng)養(yǎng)性貧血患兒6例)作為對(duì)照組。1.2標(biāo)本采集及處理分別抽取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組患兒骨髓液2ml,放入玻璃管中自然凝固,凝固后倒入含有4%多聚甲醛的玻璃瓶中保存?zhèn)溆谩Ｖ笫灠?將蠟塊取4um厚連續(xù)切片,HE染色觀察每個(gè)標(biāo)本中白血病細(xì)胞數(shù)約占有核細(xì)胞總數(shù)的50%至95%,標(biāo)本合格,行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)LC3-Ⅱ及P62蛋白的表達(dá)水平。切片采用盲法由研究者閱片。LC3-Ⅱ與P62蛋白均參照Fromowitz陽(yáng)性細(xì)胞半定量分級(jí)法的判斷方法,隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400),每個(gè)視野細(xì)胞數(shù)不少于100個(gè),細(xì)胞數(shù)過少的可選取10個(gè)高倍視野(×400),計(jì)數(shù)白血病細(xì)胞總數(shù)及白血病陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),細(xì)胞漿或者細(xì)胞核里出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。根據(jù)切片中陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比率和染色深度分別進(jìn)行評(píng)估。2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(reverse transcription-PCR,RT-PCR)另選取2014年1月至2015年5月經(jīng)上述方法確診的初診未治急性白血病患兒20例作為實(shí)驗(yàn)組,其中ALL患兒12例,AML患兒8例,及同期非惡性血液病患兒12例(包括免疫性血小板減少癥患兒7例,營(yíng)養(yǎng)性貧血患兒5例)作為對(duì)照組,分別抽取骨髓液0.5ml行RT-PCR檢測(cè)LC3-Ⅱ及P62的m RNA表達(dá)水平。標(biāo)本經(jīng)過RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等步驟電泳后經(jīng)紫外燈檢測(cè)。3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法免疫組化資料采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組間LC3-Ⅱ和P62蛋白陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn),LC3-Ⅱ和P62蛋白間的相關(guān)性采用spearman相關(guān)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR實(shí)驗(yàn)資料采用Graphpad prism 5.0,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果:1免疫組化法:LC3-Ⅱ蛋白和P62蛋白陽(yáng)性染色為棕色至棕褐色顆粒,LC3-Ⅱ位于細(xì)胞漿及部分細(xì)胞核中,P62位于細(xì)胞漿中。1.1 LC3-Ⅱ蛋白在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.00%(33/50)及15.00%(3/20),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);P62蛋白在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.00%(38/50)及55.00%(11/20),其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.2 LC3-Ⅱ蛋白在ALL兒童及對(duì)照組兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為63.33%(19/30)及15.00%(3/20),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);P62蛋白在ALL兒童及對(duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)率分別為73.33%(22/30)及55.00%(11/20),其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.3 LC3-Ⅱ蛋白在AML兒童及對(duì)照組兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為70.00%(14/20)及15.00%(3/20),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);P62蛋白在AML兒童及對(duì)照組兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.00%(16/20)及55.00%(3/20),其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.4 LC3-Ⅱ蛋白在ALL兒童及AML兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為63.33%(19/30)及70.00%(14/20);P62蛋白在ALL兒童及AML兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為73.33%(22/30)及80.00%(16/20),其差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.5 LC3-Ⅱ蛋白在男性AL、ALL及AML兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.67%(20/30)、60.00%(12/20)及80.00%(8/10),LC3-Ⅱ蛋白在女性AL、ALL、AML兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為65.00%(13/20)、70.00%(7/10)、60.00%(6/10),在AL兒童中、ALL兒童中及在AML兒童中,男性與女性LC3-Ⅱ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);P62蛋白在男性AL、ALL及AML兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.00%(24/30)、75.00%(15/20)、90.00%(9/10),P62蛋白在女性AL、ALL、AML兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為70.00%(14/20)、70.00%(7/10)、70.00%(7/10),在AL兒童中、ALL兒童中及在AML兒童中,男性與女性P62陽(yáng)性表達(dá)率的差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.6 LC3-Ⅱ蛋白在B型及T型ALL兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.67%(16/24)及50.00%(3/6),其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);P62蛋白在B型及T型ALL兒童中陽(yáng)性表達(dá)率分別為75.00%(18/24)及66.67%(4/6),其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.7經(jīng)spearman相關(guān)性分析,AL兒童中LC3-Ⅱ與P62蛋白的表達(dá)水平無明顯相關(guān)性(rs=0.249,P=0.103,P0.05)。2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果:LC3-Ⅱ基因在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中的表達(dá)均呈正太分布,實(shí)驗(yàn)組中均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為0.360±0.047,對(duì)照組中均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為1.107±0.136,兩樣本比較t=5.169,P=0.000,P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;P62在兩組數(shù)據(jù)中的表達(dá)均呈正太分布,實(shí)驗(yàn)組中均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為1.336±0.139,對(duì)照組中均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為1.610±0.449,兩樣本比較t=0.583,P=0.570,P0.05,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1自噬相關(guān)基因及蛋白LC3-Ⅱ在急性白血病中表達(dá)上調(diào),提示急性白血病兒童骨髓細(xì)胞中細(xì)胞自噬的表達(dá)水平升高,這可能與白血病發(fā)病有關(guān)。2 LC3-Ⅱ及P62蛋白在AML與ALL和男性與女性兒童AL中表達(dá)水平的比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在B型及T型ALL兒童中的陽(yáng)性率的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;提示細(xì)胞自噬表達(dá)水平的高低可能與兒童急性白血病的種類、性別及ALL的免疫表型均無明顯關(guān)系。3 Spearman相關(guān)性分析顯示,AL兒童中LC3-Ⅱ與P62蛋白的表達(dá)可能無明顯相關(guān)性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R733.71

【參考文獻(xiàn)】

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