本文關鍵詞： 細胞自噬 兒童急性白血病 LC3-Ⅱ P62 免疫組織化學 RT-PCR　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:細胞自噬是所有真核生物共有的一種保守的代謝途徑,微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)及自噬降解底物P62蛋白在細胞自噬過程中起重要作用,本實驗通過檢測LC3-Ⅱ及P62蛋白及基因在初診未治急性白血病兒童骨髓細胞中的表達程度了解急性白血病兒童骨髓細胞中細胞自噬的表達水平的高低,為從新的角度解釋兒童急性白血病的發(fā)病機制提供依據(jù),為兒童急性白血病的治療提供新思路。方法:1免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(Immunohistochemical streptavidin Perosidase)1.1病例及分組隨機選取2014年1月至2016年6月在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院兒科住院確診的初診未治急性白血病(acute leukemia,AL)患兒50例作為實驗組,其中急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)30例,包括標危13例,中危14例,高危3例,B型ALL24例,T型ALL6例;急性髓細胞性白血病(acute myelocytic leukemia,AML)20例,其中包括M1 1例,M2 5例,M3 5例,M4 4例,M5 3例,M7 2例;所有AL病例中性別組成為男孩30例,女孩20例,年齡1歲~14歲;所有患兒均經(jīng)臨床表現(xiàn)、細胞形態(tài)學(Morphology,M)、免疫學(Immunology,I)、細胞遺傳學(Cytogentics,C)和分子生物學(Molecular,M)分型(MICM)確診,同時隨機選取性別和年齡與實驗組相匹配的非惡性血液病患兒20例(其中包括免疫性血小板減少癥患兒14例,營養(yǎng)性貧血患兒6例)作為對照組。1.2標本采集及處理分別抽取實驗組及對照組患兒骨髓液2ml,放入玻璃管中自然凝固,凝固后倒入含有4%多聚甲醛的玻璃瓶中保存?zhèn)溆�。之后石蠟包�?將蠟塊取4um厚連續(xù)切片,HE染色觀察每個標本中白血病細胞數(shù)約占有核細胞總數(shù)的50%至95%,標本合格,行免疫組織化學法檢測LC3-Ⅱ及P62蛋白的表達水平。切片采用盲法由研究者閱片。LC3-Ⅱ與P62蛋白均參照Fromowitz陽性細胞半定量分級法的判斷方法,隨機選取5個高倍視野(×400),每個視野細胞數(shù)不少于100個,細胞數(shù)過少的可選取10個高倍視野(×400),計數(shù)白血病細胞總數(shù)及白血病陽性細胞數(shù),細胞漿或者細胞核里出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)切片中陽性細胞占總細胞數(shù)的比率和染色深度分別進行評估。2逆轉錄聚合酶鏈式反應法(reverse transcription-PCR,RT-PCR)另選取2014年1月至2015年5月經(jīng)上述方法確診的初診未治急性白血病患兒20例作為實驗組,其中ALL患兒12例,AML患兒8例,及同期非惡性血液病患兒12例(包括免疫性血小板減少癥患兒7例,營養(yǎng)性貧血患兒5例)作為對照組,分別抽取骨髓液0.5ml行RT-PCR檢測LC3-Ⅱ及P62的m RNA表達水平。標本經(jīng)過RNA的提取、逆轉錄、聚合酶鏈式反應等步驟電泳后經(jīng)紫外燈檢測。3統(tǒng)計學方法免疫組化資料采用SPSS21.0進行統(tǒng)計學分析,各組間LC3-Ⅱ和P62蛋白陽性率的比較采用χ2檢驗,LC3-Ⅱ和P62蛋白間的相關性采用spearman相關分析,檢驗水準α=0.05,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。RT-PCR實驗資料采用Graphpad prism 5.0,實驗組與對照組之間的比較采用兩樣本t檢驗。結果:1免疫組化法:LC3-Ⅱ蛋白和P62蛋白陽性染色為棕色至棕褐色顆粒,LC3-Ⅱ位于細胞漿及部分細胞核中,P62位于細胞漿中。1.1 LC3-Ⅱ蛋白在實驗組及對照組兒童中陽性表達率分別為66.00%(33/50)及15.00%(3/20),其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);P62蛋白在實驗組及對照組兒童中陽性表達率分別為76.00%(38/50)及55.00%(11/20),其差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。1.2 LC3-Ⅱ蛋白在ALL兒童及對照組兒童中陽性表達率分別為63.33%(19/30)及15.00%(3/20),其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);P62蛋白在ALL兒童及對照組中陽性表達率分別為73.33%(22/30)及55.00%(11/20),其差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。1.3 LC3-Ⅱ蛋白在AML兒童及對照組兒童中陽性表達率分別為70.00%(14/20)及15.00%(3/20),其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);P62蛋白在AML兒童及對照組兒童中陽性表達率分別為80.00%(16/20)及55.00%(3/20),其差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。1.4 LC3-Ⅱ蛋白在ALL兒童及AML兒童中陽性表達率分別為63.33%(19/30)及70.00%(14/20);P62蛋白在ALL兒童及AML兒童中陽性表達率分別為73.33%(22/30)及80.00%(16/20),其差異均不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。1.5 LC3-Ⅱ蛋白在男性AL、ALL及AML兒童中陽性表達率分別為66.67%(20/30)、60.00%(12/20)及80.00%(8/10),LC3-Ⅱ蛋白在女性AL、ALL、AML兒童中陽性表達率分別為65.00%(13/20)、70.00%(7/10)、60.00%(6/10),在AL兒童中、ALL兒童中及在AML兒童中,男性與女性LC3-Ⅱ蛋白陽性表達率的差異均不具有統(tǒng)計學意義(P0.05);P62蛋白在男性AL、ALL及AML兒童中陽性表達率分別為80.00%(24/30)、75.00%(15/20)、90.00%(9/10),P62蛋白在女性AL、ALL、AML兒童中陽性表達率分別為70.00%(14/20)、70.00%(7/10)、70.00%(7/10),在AL兒童中、ALL兒童中及在AML兒童中,男性與女性P62陽性表達率的差異均不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。1.6 LC3-Ⅱ蛋白在B型及T型ALL兒童中陽性表達率分別為66.67%(16/24)及50.00%(3/6),其差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05);P62蛋白在B型及T型ALL兒童中陽性表達率分別為75.00%(18/24)及66.67%(4/6),其差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。1.7經(jīng)spearman相關性分析,AL兒童中LC3-Ⅱ與P62蛋白的表達水平無明顯相關性(rs=0.249,P=0.103,P0.05)。2 RT-PCR檢測結果:LC3-Ⅱ基因在實驗組及對照組中的表達均呈正太分布,實驗組中均數(shù)±標準差為0.360±0.047,對照組中均數(shù)±標準差為1.107±0.136,兩樣本比較t=5.169,P=0.000,P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義;P62在兩組數(shù)據(jù)中的表達均呈正太分布,實驗組中均數(shù)±標準差為1.336±0.139,對照組中均數(shù)±標準差為1.610±0.449,兩樣本比較t=0.583,P=0.570,P0.05,差異不具有統(tǒng)計學意義。結論:1自噬相關基因及蛋白LC3-Ⅱ在急性白血病中表達上調,提示急性白血病兒童骨髓細胞中細胞自噬的表達水平升高,這可能與白血病發(fā)病有關。2 LC3-Ⅱ及P62蛋白在AML與ALL和男性與女性兒童AL中表達水平的比較,差異均無統(tǒng)計學意義;在B型及T型ALL兒童中的陽性率的比較差異無統(tǒng)計學意義;提示細胞自噬表達水平的高低可能與兒童急性白血病的種類、性別及ALL的免疫表型均無明顯關系。3 Spearman相關性分析顯示,AL兒童中LC3-Ⅱ與P62蛋白的表達可能無明顯相關性。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R733.71

【參考文獻】

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1 于皎樂;鄭胡鏞;;兒童急性髓細胞白血病治療新進展[J];中國實用兒科雜志;2016年04期

2 許文鋒;馮曉勤;李春富;吳學東;何岳林;張玉明;裴夫瑜;;西羅莫司誘導急性髓系白血病U937細胞自噬及凋亡[J];中華實用兒科臨床雜志;2015年17期

3 李龍平;周勇軍;王新華;全壯志;;自噬基因Atg5和MAPLC3在急性白血病中的表達及其意義[J];實用檢驗醫(yī)師雜志;2014年03期

4 蘇楠;曲藝;李艷;;自噬與惡性血液病[J];中國實驗血液學雜志;2014年04期

5 Bhavna Rani;Yuan Cao;Andrea Malfettone;Ciprian Tomuleasa;Isabel Fabregat;Gianluigi Giannelli;;Role of the tissue microenvironment as a therapeutic target in hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2014年15期

6 王麗華;張z，

本文編號：1554855