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《中國畜牧獸醫(yī)學會家畜寄生蟲學分會第六次代表大會暨第十一次學術(shù)研討會論文集》2011年

基于秀麗隱桿線蟲IRES序列雙框共表達載體的構(gòu)建

李鏑銳  汪明  

【摘要】：秀麗隱桿線蟲(C.elegans)作為模式生物在生物醫(yī)學研究領(lǐng)域起到了非常重要的作用,亦被認為是一個合適的生物反應器用來表達寄生線蟲的疫苗候選分子,這就需要獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因蟲系。目前獲得秀麗線蟲轉(zhuǎn)基因表達蟲系主要是通過目的基因與報告基因共顯微注射來產(chǎn)生,不過通過此方法,經(jīng)常得不到重組體,原因可能是兩個質(zhì)�；ハ喔蓴_而影響其表達,也許單質(zhì)粒篩選系統(tǒng)可以解決這個問題。內(nèi)核苷酸結(jié)合序列(IRES)可以吸引真核核糖體翻譯起始復合體而獨立地起始翻譯。生物信息學家預測了在秀麗線蟲熱激蛋白3(Hsp3)伴侶分子翻譯起始點上游存在著一段IRES基序,它具有Y形雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)。然而,目前還沒有實驗證實它的作用。(目的)本研究旨在用實驗驗證秀麗線蟲Hsp3翻譯起始點上游285bp片段是否可以作為IRES序列共表達兩個基因,從而構(gòu)建用于秀麗線蟲的雙框共表達載體。(方法)在我們的研究中,我們首先把這段從秀麗線蟲基因組上擴增出來的IRES序列連接到T載體上,利用T載體上的酶切位點在其上游連接RFP基因,在其下游連接GFP基因,最后把RFP-IRES-GFP片段構(gòu)建到L3786表達載體上。通過顯微注射轉(zhuǎn)基因操作把質(zhì)粒注射到線蟲性腺,對通過鏡檢表現(xiàn)為熒光陽性的重組體進行PCR,RT-PCR分析重組蟲體是否含有RFP及GFP基因,使用GFP抗體對其進行Western blotting分析,檢測IRES下游GFP是否有表達。(結(jié)果)結(jié)果驗證L3786/RFP-IRES-GFP這個載體可以在1et-858啟動子下同時表達紅熒光蛋白和綠熒光蛋白基因兩個獨立的開放性閱讀框。(結(jié)論)因此我們首次驗證了秀麗線蟲細胞中含在IRES序列,并且基于此序列構(gòu)建了雙框共表達載體,為以秀麗線蟲為研究模型的實驗室提供了一個新的有力的工具,為解決兩質(zhì)粒共轉(zhuǎn)基因表現(xiàn)出來的干擾問題奠定了基礎(chǔ)。

【作者單位】：
【分類號】：S852.731
【正文快照】：

糖基化影響寄生線蟲抗原分子的免疫原性與免疫功能。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是反當動物最嚴重的寄生線蟲之一，迄今為止具有潛力的候選抗原是隱蔽抗原Hll，其天然提取物保護率90%以上，大腸桿菌、酵母菌，昆蟲細胞表達表達的重組Hll幾乎沒有免疫保護功能。對天然Hll蛋白進行結(jié)構(gòu)分析顯

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