本文關(guān)鍵詞： 旋毛蟲(chóng) 豬 重組蛋白 體液免疫 細(xì)胞免疫 巨噬細(xì)胞 中性粒細(xì)胞　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：旋毛蟲(chóng)是一種雌雄異體的線蟲(chóng),可感染所有的哺乳動(dòng)物(包括人類(lèi))、一些食肉鳥(niǎo)類(lèi)和爬行動(dòng)物。豬是旋毛蟲(chóng)感染的最重要的宿主之一,人感染旋毛蟲(chóng)的報(bào)道中很大比例是由于患者曾食用了感染有旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的生的或未完全熟的豬肉制品。因此,預(yù)防豬感染旋毛蟲(chóng)意義重大。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)中利用感染旋毛蟲(chóng)26天和60天的豬血清分別篩選旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的cDNA文庫(kù),得到了多條強(qiáng)反應(yīng)原性的抗原基因,并初步研究了這些基因在小鼠旋毛蟲(chóng)感染模型中的免疫保護(hù)性。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)上述研究結(jié)果選取了5條(Ts-zh68、Ts-clp、Ts-T668、Ts-serpin和Ts-p45)在小鼠模型中表現(xiàn)出抗旋毛蟲(chóng)保護(hù)性且疑似參與旋毛蟲(chóng)存活、寄生或免疫逃避的重要功能基因,另選取Ts-p43和Ts-p53這兩條被報(bào)道在小鼠旋毛蟲(chóng)感染模型中保護(hù)性效果突出的基因,利用長(zhǎng)白豬作為動(dòng)物模型,開(kāi)展這七條抗原基因?qū)ωi的免疫保護(hù)作用的研究。從而為旋毛蟲(chóng)疫苗的開(kāi)發(fā)篩選高效的候選抗原和提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)分別誘導(dǎo)表達(dá)帶有His標(biāo)簽的上述七種重組蛋白,利用鎳柱進(jìn)行親和層析純化,之后經(jīng)大型垂直板SDS-PAGE電泳分離、切膠回收目的條帶,用PBS溶出膠粒中的目的蛋白,最后對(duì)蛋白進(jìn)行超濾管濃縮,經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定得到高純度的目的蛋白。七種目的蛋白純化產(chǎn)物分別與旋毛蟲(chóng)感染60天豬血清進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),確認(rèn)了它們的反應(yīng)原性。佐劑的篩選對(duì)于重組蛋白疫苗的研發(fā)十分關(guān)鍵,弗氏佐劑是實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最廣泛的佐劑,但由于其本身的毒性以及對(duì)肉制品品質(zhì)的影響,限制其在動(dòng)物疫苗中的臨床應(yīng)用。一些新型疫苗佐劑在以旋毛蟲(chóng)感染小鼠為模型的疫苗研究中表現(xiàn)突出,但鑒于這些研究中所使用抗原的多樣性,無(wú)法確定最佳佐劑。因此,本研究中以rTs-Serpin為代表性重組抗原,比較了三種不同類(lèi)型的佐劑(Montanide ISA201,Montanide IMS 1313 N PR VG和弗氏完全及不完全佐劑)在以旋毛蟲(chóng)感染小鼠為模型的疫苗研究中的表現(xiàn),具體包括評(píng)估佐劑促進(jìn)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。佐劑篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與其他兩種佐劑添加組相比,ims1313佐劑添加后的疫苗能夠誘導(dǎo)最好的和最持久的igg抗體,誘導(dǎo)igm的最高峰值要比其他兩種佐劑添加組提前兩周出現(xiàn),此外,ims1313佐劑添加組誘導(dǎo)小鼠血清中產(chǎn)生高水平的th1和th2型細(xì)胞因子。總之,結(jié)合有免疫刺激復(fù)合物的水分散性的液態(tài)納米顆粒佐劑montanideims1313nprvg,展現(xiàn)出與弗氏佐劑相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性和優(yōu)于弗氏佐劑的免疫增強(qiáng)效果,是旋毛蟲(chóng)疫苗研究可選用的理想的佐劑。且該佐劑具有無(wú)需乳化、使用方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。因此,montanideims1313nprvg被選用為后續(xù)研究中的佐劑。本研究中以長(zhǎng)白豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)估以上七種重組蛋白抗旋毛蟲(chóng)感染的保護(hù)性。實(shí)驗(yàn)共分為10個(gè)組,七個(gè)重組蛋白組、pbs組、pbs+ims1313佐劑組以及空白豬對(duì)照組,每組6頭兩月齡長(zhǎng)白仔豬。共進(jìn)行兩次免疫接種,間隔4周,每頭豬每次接種1mg重組蛋白,二免3周后各實(shí)驗(yàn)組(除空白豬對(duì)照組)均灌胃感染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)(t.spiralis),每頭感染5000條肌幼蟲(chóng)。攻蟲(chóng)感染六周后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,每頭豬分別采集15個(gè)部位的肌肉,每個(gè)部位肌肉采集50g,最低不少于5g,用于消化收取旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng),計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的平均lpg(每克肌肉中的幼蟲(chóng)數(shù)),以及比較各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于pbs對(duì)照組的肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,以上七種重組蛋白在旋毛蟲(chóng)豬感染模型中保護(hù)性與在小鼠感染模型中存在很大差異。rts-t668、rts-clp、rts-zh68、rts-serpin、rts-p45、rts-p43和rts-p53在旋毛蟲(chóng)豬感染模型中表現(xiàn)出的肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率分別為51.31%、31.03%、45.21%、4.79%、3.66%、38.92%和2.39%。實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出保護(hù)力的四種蛋白中,肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率超過(guò)40%的兩種蛋白分別來(lái)源于旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)期和新生幼蟲(chóng)期,均為旋毛蟲(chóng)發(fā)育早期,這提示旋毛蟲(chóng)發(fā)育早期的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子可作為較好的旋毛蟲(chóng)疫苗候選抗原。此外,研究中還采集所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膈肌,經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片后進(jìn)行he染色,觀察和比較各實(shí)驗(yàn)組膈肌中旋毛蟲(chóng)包囊形態(tài)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各重組蛋白免疫組的膈肌旋毛蟲(chóng)包囊出現(xiàn)不同程度的形態(tài)變化,包囊周?chē)准?xì)胞侵潤(rùn)的強(qiáng)度也存在差異,而pbs+ims1313組的旋毛蟲(chóng)包囊形態(tài)和周?chē)准?xì)胞侵潤(rùn)情況與pbs組相比無(wú)明顯差異。rts-t668和rts-clp組中觀察到部分旋毛蟲(chóng)包囊形態(tài)變得相對(duì)其他各組更圓潤(rùn),膠原層結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化;rts-zh68、rts-p45、rts-p53和rTs-p43中旋毛蟲(chóng)包囊的膠原囊不同程度的出現(xiàn)邊緣不整齊或膠原層變薄;而rTs-serpin組旋毛蟲(chóng)包囊形態(tài)完整,無(wú)明顯變化。此外,rTs-zh68、rTs-T668和rTs-p43組旋毛蟲(chóng)包囊周?chē)准?xì)胞侵潤(rùn)相對(duì)劇烈,提示這些組中旋毛蟲(chóng)的膠原囊受損情況較嚴(yán)重。而rTs-clp、rTs-serpin、rTs-p45和rTs-p53組旋毛蟲(chóng)包囊周?chē)准?xì)胞侵潤(rùn)情況較輕微。為了深入理解重組蛋白的免疫保護(hù)作用,評(píng)價(jià)這七種重組蛋白抗原誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)旋毛蟲(chóng)的保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力。本研究評(píng)估了各實(shí)驗(yàn)組重組蛋白免疫接種后體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的情況,具體包括血清中相應(yīng)蛋白特異性IgG、IgG1、IgG2和IgM抗體水平變化趨勢(shì),Th1(IFN-γ、IL-2)和Th2(IL-10、IL-4)型細(xì)胞因子水平變化,以及二免兩周后T、B淋巴細(xì)胞變化情況,旋毛蟲(chóng)感染后第六天天然免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)的變化情況。結(jié)果顯示重組蛋白rTs-T668、rTs-clp和rTs-zh68免疫后均能使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在感染旋毛蟲(chóng)后始終或者某一段時(shí)期內(nèi)處于Th1型免疫應(yīng)答占優(yōu)勢(shì)的Th1/Th2混合免疫應(yīng)答狀態(tài)。各重組蛋白組二免后兩周均能誘導(dǎo)Th1(IFN-γ、IL-2)和Th2(IL-10、IL-4)型細(xì)胞因子水平顯著升高(p0.05)。重組蛋白rTs-clp和rTs-p43免疫組與PBS對(duì)照組相比,巨噬細(xì)胞水平顯著升高(p0.05),均能夠消除旋毛蟲(chóng)感染后(Ad6)對(duì)巨噬細(xì)胞的抑制作用。與未感染旋毛蟲(chóng)的空白對(duì)照組相比,在感染旋毛蟲(chóng)后(Ad6),PBS組、佐劑+PBS組、rTs-p45組和rTs-p53組中性粒細(xì)胞水平顯著下降(p0.05),這說(shuō)明旋毛蟲(chóng)對(duì)中性粒細(xì)胞存在顯著的免疫抑制作用,而rTs-clp和rTs-p43兩組在感染旋毛蟲(chóng)后(Ad6)誘導(dǎo)了中性粒細(xì)胞水平略升高,雖不顯著,但提示這兩組中旋毛蟲(chóng)對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用被消除。綜合保護(hù)性實(shí)驗(yàn)和保護(hù)性免疫應(yīng)答能力評(píng)估結(jié)果,推測(cè)重組蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗旋毛蟲(chóng)保護(hù)性效果可能與多個(gè)保護(hù)性免疫應(yīng)答因素有關(guān),誘導(dǎo)Th1型占優(yōu)勢(shì)的Th1/Th2混合免疫應(yīng)答,同時(shí)促進(jìn)維持正常水平的天然免疫應(yīng)答能力,可能是預(yù)防豬感染旋毛蟲(chóng)的免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.7

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