發(fā)布時間：2018-02-26 13:37

  本文關(guān)鍵詞： 干細(xì)胞 骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)類 基因療法 組織工程 分化 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 骨組織工程 基因治療 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 成骨分化　出處：《中國組織工程研究》2017年17期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：背景:由于人與動物之間蛋白基因的非完全同源性,人源基因構(gòu)建組織工程人工骨促進(jìn)動物成骨或脊柱融合影響了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證效果。目的:構(gòu)建可穩(wěn)定表達(dá)分泌人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的組織工程種子細(xì)胞系。方法:以巢式RT-PCR方法從人肌肉組織中克隆人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因全長基因,純化后連接構(gòu)建pc DNA3-h BMP2真核表達(dá)載體系統(tǒng),實(shí)驗(yàn)組利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染修飾人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,置于G418培養(yǎng)液中篩選培養(yǎng),設(shè)定空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(陽性對照組)及正常培養(yǎng)細(xì)胞(空白對照組)作為對照,觀察檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長增殖生物學(xué)性狀;在培養(yǎng)48 h和3周后,行人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 m RNA基因表達(dá)的RT-PCR測定,人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2蛋白表達(dá)和分泌的免疫組織化學(xué)和免疫酶斑點(diǎn)測定,以及轉(zhuǎn)染1周后細(xì)胞成骨潛能堿性磷酸酶比活性的檢測。結(jié)果與結(jié)論:(1)轉(zhuǎn)染人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成簇樣生長聚集,傳代培養(yǎng)生長增殖良好,G418篩選培養(yǎng)可得到抗性細(xì)胞克隆,有類似鈣結(jié)節(jié)樣形成,細(xì)胞增殖與兩對照組無差異;(2)RT-PCR、免疫酶斑點(diǎn)及免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果檢測,實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染48 h和3周時均能轉(zhuǎn)錄和表達(dá)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2,轉(zhuǎn)染48 h的表達(dá)較3周時要高,兩對照組未見有明顯蛋白轉(zhuǎn)錄表達(dá);(3)正常培養(yǎng)或G418篩選培養(yǎng)時,實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶比活性顯著高于陽性對照組、空白對照組(P0.01);(4)結(jié)果表明,人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因轉(zhuǎn)染修飾的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長增殖分化等生物學(xué)活性良好,可穩(wěn)定表達(dá)分泌外源轉(zhuǎn)染基因人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2。
[Abstract]:Background: due to the incomplete homology of human and animal protein genes, Human gene construction of tissue engineering artificial bone promotes animal osteogenesis or spinal fusion. Objective: to construct a tissue engineering seed cell line which can stably express and secrete human bone morphogenetic protein-2. Methods: to construct a tissue engineering seed cell line which can secrete human bone morphogenetic protein-2. Human bone morphogenetic protein-2 gene was cloned from human muscle tissue by nested RT-PCR. After purification, the eukaryotic expression vector system of PC DNA3-h BMP2 was constructed. The experimental group was transfected with liposome to modify human bone marrow mesenchymal stem cells and cultured in G418 medium. The biological characters of growth and proliferation of transfected cells were observed after 48 h and 3 weeks of culture. The expression of human bone morphogenetic protein 2 m RNA gene was detected by RT-PCR, and the expression and secretion of human bone morphogenetic protein 2 protein were detected by immunohistochemistry and immunoenzyme spots. Results and conclusion Human bone morphogenetic protein-2 gene transfected human bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) grew and aggregated in clusters after one week of transfection of osteoblast potential alkaline phosphatase (ALP) activity. The resistant cell clones were obtained by G418 screening, which were similar to calcium nodule formation. The proliferation of cells was similar to that of the two control groups. The results of immunoenzyme spots and immunohistochemistry were detected. Human bone morphogenetic protein 2 was transcribed and expressed at 48 h and 3 weeks after transfection in the experimental group, and the expression at 48 h after transfection was higher than that at 3 weeks. The specific activity of alkaline phosphatase in the experimental group was significantly higher than that in the positive control group. The results showed that the human bone morphogenetic protein-2 gene transfection modified human bone marrow mesenchymal stem cells had good biological activities, such as growth, proliferation, differentiation and so on. Stable expression and secretion of exogenous gene transfected human bone morphogenetic protein 2.
【作者單位】： 北京大學(xué)深圳醫(yī)院脊柱外科;深圳市脊柱外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2014654) 深圳市科技創(chuàng)新委員會基金(JCYJ20150403091443319)~~
【分類號】：R318.08;R68

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本文編號：1538247