發(fā)布時(shí)間：2018-02-26 12:01

  本文關(guān)鍵詞： 轉(zhuǎn)基因白絨山羊 基因沉默 啟動(dòng)子甲基化 組蛋白乙�；� 5-Az TSA 體細(xì)胞克隆　出處：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：轉(zhuǎn)基因沉默(Transgenic Silencing)現(xiàn)象普遍存在于轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物上,因而給轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育和應(yīng)用價(jià)值帶來(lái)了新的難題。目前,學(xué)界對(duì)轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象及其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究。從所報(bào)道的轉(zhuǎn)基因沉默的例子來(lái)看,幾乎所有的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象都與外源啟動(dòng)子的甲基化、組蛋白乙�；惓＜巴庠椿蚩截悢�(shù)有關(guān)。在過(guò)去5年時(shí)間里,本實(shí)驗(yàn)室累計(jì)獲得了上百只攜帶報(bào)告基因DsRed(Red fluorescence protein from Discosoma sp.�？t色熒光蛋白)的PO代轉(zhuǎn)基因白絨山羊,其中一部分存在轉(zhuǎn)基因沉默的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象會(huì)嚴(yán)重制約轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源基因的有效表達(dá),對(duì)轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象的機(jī)理進(jìn)行研究,并對(duì)其提出可能的解決方案,可以為今后提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源基因的表達(dá)效率提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究從以上轉(zhuǎn)基因白絨山羊中選取了有代表性的6只進(jìn)行研究,培養(yǎng)其耳尖成纖維細(xì)胞,以及一部分表皮來(lái)源的細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),在熒光激發(fā)器激發(fā)下,與對(duì)照組相比,在部分成年轉(zhuǎn)基因白絨山羊個(gè)體及所采細(xì)胞樣品中均檢測(cè)不到紅色熒光,這與CMV啟動(dòng)子的特性并不相符,表明發(fā)生了轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)對(duì)選取的轉(zhuǎn)基因白絨山羊檢測(cè)發(fā)現(xiàn),其基因組中均具有完整的外源DsRed基因表達(dá)框。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果顯示,僅在編號(hào)為ZK110321的個(gè)體中DsRed mRNA較其他個(gè)體表達(dá)量稍高,但仍低于核供體細(xì)胞CFC3-KI的表達(dá)水平。Western Blot的檢測(cè)結(jié)果顯示,只有ZK110324-1個(gè)體和CFC3-KI細(xì)胞可以檢測(cè)到DsRed蛋白的表達(dá)。并且根據(jù)來(lái)自ZK0311-1和ZK110324-1個(gè)體的成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的DsRed mRNA表達(dá)量的不同的結(jié)果可以推斷,CMV啟動(dòng)子在白絨山羊不同組織中的沉默程度有所不同。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)的絕對(duì)定量方法獲得了6只轉(zhuǎn)基因白絨山羊的外源基因拷貝數(shù),但均與DsRed表達(dá)量無(wú)顯著相關(guān)性,排除了外源基因拷貝數(shù)對(duì)DsRed基因表達(dá)量的影響。通過(guò)重亞硫酸氫鹽測(cè)序的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因白絨山羊進(jìn)行CMV啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)的研究。本實(shí)驗(yàn)中6只健康轉(zhuǎn)基因白絨山羊和未經(jīng)克隆的核供體細(xì)胞CFC3-KI外源CMV啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)數(shù)據(jù)顯示,有4只成體轉(zhuǎn)基因白絨山羊的外源基因啟動(dòng)子處于很高的甲基化狀態(tài)(77.4%-88.2%)有一只處于中等偏高的甲基化狀態(tài)(58.7%),有一只轉(zhuǎn)基因白絨山羊外源基因啟動(dòng)子處于較低的甲基化狀態(tài)(21.0%),未經(jīng)克隆的核供體細(xì)胞甲基化程度很低(14.3%)。將以上數(shù)據(jù)與DsRed基因的表達(dá)情況關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因白絨山羊外源基因的表達(dá)水平與啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)呈顯著負(fù)相關(guān)。因此外源CMV啟動(dòng)子的甲基化水平高是外源基因沉默的主要原因。為使轉(zhuǎn)基因白絨山羊細(xì)胞中發(fā)生沉默的外源基因恢復(fù)表達(dá),本實(shí)驗(yàn)采用了甲基化酶抑制劑5氮雜胞苷(5-Azacytidine,5-Az)和去乙�；敢种苿┣乓志谹(Trichostatin A, TSA)處理的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因白絨山羊細(xì)胞。首先以ZK0311-1和ZKl 10324-1個(gè)體的成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞進(jìn)行了最適藥物濃度的篩選,結(jié)果為：處理成纖維細(xì)胞最適5-Az濃度為5μmol/L,TSA濃度為5μmol/L,處理表皮細(xì)胞的最適5-Az濃度為20μmol/L,TSA濃度為1μmol/L。5-Az的處理時(shí)間為7d,TSA的處理時(shí)間為24h。之后使用該濃度處理其他轉(zhuǎn)基因白絨山羊耳尖成纖維細(xì)胞后獲得了良好的外源DsRed基因恢復(fù)表達(dá)的效果,經(jīng)5-Az的處理,使ZK110324-2耳尖成纖維細(xì)胞中DsRed mRNA的表達(dá)量提高了50.19倍；經(jīng)TSA的處理,使ZK0311-1耳尖成纖維細(xì)胞中DsRed mRNA的表達(dá)量提高了15.08倍。另對(duì)5-Az處理組的6只轉(zhuǎn)基因白絨山羊耳尖成纖維細(xì)胞及核供體細(xì)胞外源CMV啟動(dòng)子的甲基化水平進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明ZK0311-1、ZK110324-1和ZK110324-2的耳尖成纖維細(xì)胞CMV啟動(dòng)子的甲基化水平都有顯著下降,驗(yàn)證了5-Az降低外源基因啟動(dòng)子甲基化水平的有效性。在藥物最適濃度篩選實(shí)驗(yàn)中TSA濃度與DsRed mRNA的表達(dá)量與呈劑量依賴型關(guān)系,推斷組蛋白乙�；惓Ｒ彩菍�(dǎo)致轉(zhuǎn)基因白絨山羊外源基因沉默的原因之一。對(duì)所獲得的兩只在全身和細(xì)胞水平均未表達(dá)紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因白絨山羊(ZK0310-1和ZK0311-1)耳尖成纖維細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞克隆,經(jīng)過(guò)卵母細(xì)胞的綜合重編程作用,紅色熒光在核移植重構(gòu)胚胎中獲得了恢復(fù)表達(dá)。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)我們得出：轉(zhuǎn)基因白絨山羊不同個(gè)體中外源基因表達(dá)并不相同,甚至發(fā)生外源基因沉默,這與外源基因的CMV啟動(dòng)子的甲基化以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的組蛋白異常乙�；嘘P(guān)；CMV啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因白絨山羊不同組織中的沉默程度有所不同；甲基化酶抑制劑5-Az以及去乙�；敢种苿㏕SA的處理對(duì)轉(zhuǎn)基因白絨山羊細(xì)胞的外源基因表達(dá)模式又有一定的改變作用,且使用TSA和5-Az進(jìn)行處理是提高外源基因表達(dá)效率的有效措施；將外源基因沉默的轉(zhuǎn)基因白絨山羊細(xì)胞作為供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞克隆也有助于外源基因的恢復(fù)表達(dá)。
[Abstract]:In the past five years , we found that there is no significant correlation between the expression of exogenous gene in transgenic animals and the expression level of exogenous gene . The results showed that the expression level of the promoter of the exogenous gene was increased by 15.08 times . The results showed that the expression of the exogenous gene was increased by 15.08 times . The results showed that the expression of the exogenous gene was increased by 15.08 times . The results showed that the expression of the exogenous gene was not the same as that of the exogenous gene . The results showed that the expression of the exogenous gene was not identical with the expression of the exogenous gene .

【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1537924